Memilih Antibodi Primer atau Sekunder

Bagaimana memilih antibodi primer atau sekunder dengan benar dan cocok untuk penelitian

 Aplikasi

Pada datasheet antibodi dijelaskan daftar aplikasi apa saja yang telah berhasil diuji. Juga, tetap dijelaskan, ketika antibodi digunakan untuk aplikasi lainnya dan gagal. Jika aplikasi tidak dicantumkan dalam daftar tersebut, itu berarti belum pernah diuji dan tidak diketahui pasti bagaimana kinerja antibodi tersebut. Setiap antibodi yang dijual telah diuji terlebih dahulu dan datasheet selalu diperbaharui dengan hasil aplikasi terakhir.

Indogen menjual antibodi merk ABCAM dan merk lainnya, misalnya saja untuk aplikasi beriku:

Sifat sample

Sifat sampel akan menentukan antibodi mana yang tepat. Pertimbangkan beberapa aspek berikut:

  • Bagian protein yang ingin dideteksi

Antibodi dihasilkan dengan mengimunisasikan hewan inang dengan substansi immunogenik. Immunogen bisa berupa protein panjang-penuh, fragmen protein, peptida, organisme utuh (misalnya bakteri) atau sel. Immunogen umumnya dijelaskan dalam datasheet (pada beberapa kasus tidak dijelaskan secara rinci mengenai immunogennya berkenaan dengan HAKI).

Cek apakah immunogennya identik atau mengandung bagian protein yang akan dideteksi. Sebagai contoh, jika Anda mencoba untuk mendeteksi protein pada permukaan sel hidup dengan FACS, pilihlah antibodi yang mengenali domain protein ekstraseluler.

  • Pemrosesan sample

Beberapa antibodi membutuhkan perlakuan sample yang spesifik. Banyak antibodi hanya akan mengenali protein yang telah direduksi dan didenaturasi,  hal ini  karena epitop tersingkap yang sebelumnya tertutupi lipatan protein sekunder dan tersier. Di kasus lainnya, antibodi hanya akan mengenali epitope pada protein dalam keadaan aslinya yang terlipat. Antibodi ABCAM untuk western blot mengharuskan sampel dikurangi dan didenaturasi, kecuali dinyatakan lain pada datasheetnya.

Untuk Imunohistokimia atau disingkat IHK, beberapa antibodi hanya cocok untuk unfixed frozen tissue. Antibodi lainnya tidak bisa berikatan dengan targetnya pada jaringan FFPE (formalin-fixed, paraffin-embedded tissue) tanpa tahap antigen retrieval yang membalikan ikatan-silang yang diawali dengan fiksasi formalin. Keterangan pembatasan penggunaan ini dijelaskan dalam datasheet.

Spesies Sample

Jika memungkinkan, pilihlah antibodi yang telah dibuat terhadap spesies yang sama dengan sampel Anda. Antibodi tersebut dapat bereaksi dengan protein target yang sama dari spesies lain yang memiliki homologi sekuens asam amino. Jika sampel Anda bukan dari salah satu spesies yang tercantum dalam lembar data, ini berarti bahwa spesies tersebut belum diuji dan ABCAM tidak dapat memberikan garansi bahwa antibodi tersebut dapat digunakan. Prediksi reaktivitas silang berdasarkan atas kesamaan sekuens.

* * * * * * *

 Memilih Spesies Inang Antibodi Primer ​

Spesies dimana antibodi primer dihasilkan harus berbeda dari spesies sampel Anda. Hal ini dimaksudkan untuk mencegah reaktivitas-silang antibodi anti-immunoglobulin sekunder dengan imunoglobulin endogen dalam sample. Sebagai contoh, jika Anda meneliti protein tertentu pada mencit, pilih antibodi yang dihasilkan selain dari mencit. Antibodi primer yang diproduksi di kelinci merupakan pilihan bagus, kemudian ditautkan dengan anti-rabbit IgG secondary antibody.

Untuk teknik yang menggunakan sampel yang tidak mengandung imunoglobulin endogen (IgG), pilihan spesies inang dari antibodi primer tidak begitu penting. Contohnya adalah western blotting sel lisat yang tidak diharapkan mengandung IgG. Namun, lisat jaringan dan supernatan kultur jaringan yang mengandung serum akan mengandung immunoglobulin juga. IgG akan muncul pada western blot sebagai pita 50 kDa dan 25kDa sesuai dengan berat molekul rantai-berat dan ringan.

* * * * * * *

 Memilih Antibodi sekunder

Antibodi sekunder harus berbeda spesies inang dari antibodi primer yang Anda gunakan. Misalnya, jika antibodi primer yang Anda gunakan adalah mouse monoklonal, Anda akan memerlukan anti-mouse sekunder. Periksa  datasheet antibodi sekunder ABCAM untuk memastikan antibodi tersebut telah digunakan pada aplikasi yang akan Anda gunakan.

Mengenai pemilihan antibodi sekunder ABCAM yang tepat, kami telah merangkumnya dalam beberapa artikel berikut:

 * * * * * * *

 Memilih Antibodi untuk Pewarnaan Ganda (Dual Staining)

Pewarnaan ganda atau Double immunostaining kultur sel atau kultur jaringan membutuhkan antibodi primer yang dihasilkan pada spesies berbeda dan antibodi sekunder akan mengenali salah satunya secara spesifik. Silakan pilih dari koleksi anti-Ig sekunder ABCAM yang telah di pra-serap terhadap imunoglobulin dari spesies lainnya untuk menghilangkan reaktivitas-silang. Atau alternatif lainnya, antibodi primer ABCAM yang langsung terkonjugasi sehingga tidak memerlukan lagi antibodi sekunder.

 * * * * * * *

​Fluorokrom dan Label kromogen

Label dikonjugasikan ke antibodi untuk memvisualisasikan keberadaan protein target. Pilihan label tergantung pada aplikasi penelitian.

  • Label fluorescent memancarkan cahaya dalam kisaran visual ketika tereksitasi oleh panjang gelombang cahaya tertentu. Tersedia dalam beberapa pilihan karakteristik eksitasi dan emisinya.
  • Label enzimatik horseradish peroxidase (HRP) dan alkaline phosphatase (AP) membentuk endapan berwarna ketika dikombinasikan dengan substrat yang sesuai.
  • Antibodi yang terbiotinilasi berguna untuk amplifikasi sinyal ketika diikuti oleh kompleks avidin-biotin-enzim atau kompleks fluorokrom (biasanya disingkat sebagai reagen ABC), atau avidin atau streptavidin yang terkonjugasi dengan enzim atau fluorokrom.