Apa itu Gradient PCR?

Dalam bidang biologi molekuler dan genetika, terdapat metode yang dikenal dengan prinsip Polymerase Chain Reaction atau PCR. PCR terdiri dari kata Polymerase yang merupakan enzim dan Chain Reaction berarti untai berantai, sehingga memiliki arti enzim yang mampu menggabungkan DNA cetakan tunggal, membentuk untaian molekul DNA yang panjang. Dalam bidang molekuler, PCR merupakan teknik untuk mengamplifikasi sekuen DNA spesifik menjadi ribuan sampai jutaan kopi sekuen DNA.

Prinsip terjadinya reaksi dalam PCR adalah dengan adanya sifat komplementer antara rantai DNA target melalui bantuan enzim polimerase, deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP), buffer PCR, magnesium klorida dan oligonukleotida sebagai primer yang ketika semua dicampurkan reaksinya akan dipicu dengan perubahan suhu di dalam mesin thermocycler (Nuryady dkk., 2020)

Masalah dengan amplifikasi fragmen DNA tertentu menggunakan PCR merupakan kejadian sehari-hari di laboratorium. Pita sekunder nonspesifik dapat terbentuk setelah reaksi PCR, yang menghambat, atau bahkan mencegah, analisis lebih lanjut (pengurutan siklus, deteksi mutasi, dll.) atau penilaian yang tegas terhadap hasil PCR. Dalam kasus seperti itu, kondisi PCR harus dioptimalkan. Hal ini biasanya dicapai dengan mentitrasi konsentrasi magnesium, template, primer, dNTP, dan Taq-Polimerase, “Hot Start PCR,” “Touch-down PCR,” menambahkan deterjen, mengurangi siklus PCR atau dengan meningkatkan suhu annealing secara bertahap.

Pemilihan suhu annealing mungkin merupakan komponen paling penting untuk mengoptimalkan spesifisitas reaksi PCR. Dalam kebanyakan kasus, suhu ini harus diuji secara empiris. PCR biasanya dimulai pada 5°C di bawah suhu titik leleh primer (Tm) yang dihitung. Namun, kemungkinan terbentuknya pita sekunder non-spesifik menunjukkan bahwa suhu optimum seringkali jauh lebih tinggi daripada suhu yang dihitung (>12°C) (Prezioso dan Jahns, 2000).

Salah satu teknologi canggih terbarukan yaitu adanya fungsi PCR Gradient yang disebut sebagai Gradient PCR. Gradient PCR merupakan salah satu metode yang dapat digunakan untuk mengetahui optimasi suhu annealing pada DNA. Teknik ini merupakan modifikasi yang dilakukan untuk meningkatkan keberhasilan dalam amplifikasi.

Prinsip Gradient PCR

Gradien berarti “sesuatu yang meningkat atau menurun.” Maka, ketika kita menggunakan istilah PCR gradien, artinya kita dapat meningkatkan atau menurunkan suhu dalam satu mesin. Suhu annealing merupakan bagian penting dari reaksi PCR; suhu annealing yang terlalu tinggi dan terlalu rendah dapat mengakibatkan kegagalan reaksi dan amplifikasi yang tidak spesifik. Untuk mencapai amplifikasi yang sangat baik, diperlukan suhu annealing yang optimal. Kisaran suhu annealing yang ideal adalah antara 57ºC hingga 65ºC. Misalnya, beberapa DNA templat dapat diamplifikasi pada suhu 59ºC, dan beberapa dapat diamplifikasi pada suhu annealing 61,5ºC atau 65ºC. Hal ini bervariasi dari templat ke templat dan protokol ke protokol.

Dalam PCR gradien, kita dapat mengatur gradien suhu yang berbeda dalam sepasang kolom sehingga suhu pemanasan yang berbeda dapat diuji untuk percobaan tertentu. Mesin ini sedikit berbeda dibandingkan dengan mesin PCR konvensional, karena berisi blok pemanas terpisah untuk pasangan kolom yang berbeda. PCR konvensional hanya berisi satu blok pemanas yang mendistribusikan satu suhu di semua sumur. Sedangkan PCR gradien memiliki zona suhu yang berbeda di pasangan kolom yang berbeda.

Pada prinsipnya, PCR gradien dapat menguji beberapa suhu annealing serta parameter lainnya dalam satu kali pengujian. PCR gradien dapat menciptakan perbedaan suhu di berbagai kolom, sehingga memungkinkan kita untuk dengan cepat mengidentifikasi kombinasi suhu dan parameter terbaik untuk reaksi tersebut..

Keuntungan dan Kekurangan PCR Gradient

Waktu adalah segalanya dalam laboratorium genetik molekuler, karena langkah atau prosedur ini membutuhkan banyak waktu. PCR Gradien adalah opsi yang menghemat waktu. Kita tidak perlu menjalankan reaksi terpisah untuk suhu dan parameter yang berbeda. PCR Gradien memungkinkan multiplexing banyak reaksi dalam satu kali proses. Jika kita memiliki 5 eksperimen berbeda dan ingin menjalankannya dalam satu reaksi, kita dapat mengatur suhu annealing masing-masing dan menjalankan setiap eksperimen dalam satu kali proses PCR.

PCR Gradien sangat mengurangi kemungkinan hasil yang salah dan meningkatkan kemungkinan tingkat keberhasilan dengan menguji berbagai suhu annealing yang mungkin untuk eksperimen secara sistematis. PCR Gradien memerlukan lebih sedikit reagen, bahan kimia, dan penggunaan lainnya.

Salah satu keterbatasan penting PCR gradien adalah rentang gradien yang terbatas. Kita tidak dapat mengatur suhu gradien di atas atau di bawah rentang mesin. Misalnya, jika mesin memiliki rentang >5ºC, kita tidak dapat mengatur perbedaan suhu lebih dari itu.

Produk Gradient PCR

RWD

RWD adalah produsen terkemuka di dunia untuk instrumen penelitian ilmu hayati, dan perangkat medis. Kantor pusat RWD berlokasi di Shenzhen, China. Adapun beberapa instrument Gradient PCR yang ditawarkan dari merk RWD sebagai berikut.

Tabel 1. Instrument Gradient Thermal Cycler dari RWD

Katalog	Deskripsi	Ukuran Sampel	Model
M296G	M2-96G Gradient Thermal Cycler	96×0.2 ml/0.1ml tubes or 1×96-well plate

BIO-GENER

Hangzhou Baiheng Technology Co., LTD atau yang dikenal dengan BIO-GENER merupakan produsen mesin PCR berkualitas tinggi dengan komponen Marlow Peltier dari USA untuk memastikan performa, menambah kecepatan dan mesin awet. Semua produknya sudah tersertifikasi CE sehingga kualitas terjamin dengan tetap memperhatikan harga yang kompetitif. Berikut adalah instrumen pilihan gradient PCR.

Tabel 2. Instrument Gradient Thermal Cycler dari BIO-GENER

Katalog	Deskripsi	Ukuran Sampel	Model
RePure T series Gradient Thermal Cycler	RePure-T Normal gradient	3×32×0.2ml
	RePure-T(F) 8℃/S normal gradient
	RePure-D(B) Normal gradient
RePure D series Gradient Thermal Cycler	RePure-D Two dimensional gradient	64×0.2ml (A block) + 32×0.2ml (B block)
	RePure-D(F) Super fast gradient
	RePure-D(P) Super fast two dimensional gradient
	RePure-A	96×0.2ml Normal gradient
	RePure-A(F)	96×0.2ml Normal gradient
RePure Series Gradient Thermal Cycler	RePure-A(384)	384well Normal gradient
	RePure-B	96×0.2ml Dynamic gradient
	RePure-C	96×0.2ml Two dimensional gradient
	RePure-F	96×0..2ml Normal gradient
Double Block Gradient Thermal Cycler	GE4832T	48×0.2ml +30×0.5ml
	GE4851T	2×48×0.2ml
	GE4852T	2×48×0.2ml
32×0.2ml×3 Gradient Thermal Cycler	GET3X	32×0.2ml×3
	GET3XG	32×0.2ml×3
Dynamic Gradient Thermal Cycler	GET96-PLUS	96×0.2ml （16x6x0.2ml)
96 Well Gradient Thermal Cycler	GE9612T-S	96×0.2ml
	GE9612T	96×0.2ml
384 Well Gradient Thermal Cycler	GE3842T-S	384 microwell
	GE3842T	384 microwell
60×0.5ml Well Gradient Thermal Cycler	G6022T-S	60×0.5ml
	GE6022T	60×0.5ml

Untuk pertanyaan produk dan stock lebih lanjut Bapak/Ibu dapat menghubungi kami PT. Indogen melalui email asri.indogen@gmail.com atau melalui WhatsApp berikut untuk fast respon WhatsApp Indogen.

Referensi :

Nuryady, M. M., Husamah, H., Miharja, F. J., Hindun, I., dan Patmawati, P. (2020). Desain dan Optimasi Primer Gen Pengkode MRPA Trypanosoma evansi dan Penerapan pada Pembelajaran Biologi Molekuler. Jurnal Penelitian dan Pengkajian Ilmu Pendidikan: e-Saintika, 4(2), hal 223 – 233.

Prezioso, V. R., dan Jahns, A. (2000). Using Gradient PCR to Determine the Optimum Annealing Temperature. Drug Discover Online. Accessed at: https://www.drugdiscoveryonline.com/doc/using-gradient-pcr-to-determine-the-optimum-a-0002

Artikel Terkait

1. https://indogen.id/tahukah-anda-tentang-conventional-pcr-pcr-konvensional/#:~:text=Salah%20satu%20teknologi%20canggih%20terbarukan,untuk%20meningkatkan%20keberhasilan%20dalam%20amplifikasi.
2. https://indogen.id/mengenal-berbagai-prinsip-metode-polymerase-chain-reaction-pcr-dengan-introduksi-produk-multiplex-rt-qpcr-kit-dan-digital-pcr-kit-dari-genmark/
3. https://indogen.id/pengujian-pcr-dan-rapid-test-dalam-biobank/
4. https://indogen.id/metode-molekuler-deteksi-kanker-darah-dengan-genmark-genemap-rt-qpcr-kits/