A. Pendahuluan

Kanker pankreas adalah jenis kanker yang berasal dari sel-sel di pankreas, organ penting yang berperan dalam produksi enzim pencernaan dan hormon pengatur gula darah. Kanker ini seringkali sulit dideteksi pada tahap awal karena gejalanya yang tidak spesifik dan baru muncul ketika kanker sudah menyebar ke organ lain.

Gejala kanker pankreas biasanya baru muncul saat kanker sudah lanjut, seperti nyeri perut, penurunan berat badan, dan jaundice (kulit dan mata menguning). Faktor risiko meliputi usia, riwayat keluarga, merokok, obesitas, dan diabetes

Sel tunggal dari jaringan kanker pankreas adalah sel-sel kanker yang tumbuh secara tidak terkendali di pankreas dan dapat diisolasi dari jaringan tumor untuk analisis lebih lanjut. Kanker pankreas sendiri biasanya berupa adenokarsinoma yang berasal dari sel eksokrin pankreas, terutama sel yang melapisi saluran pankreas.

Isolasi sel tunggal dari jaringan ini penting untuk memahami karakteristik molekuler dan heterogenitas tumor, serta untuk mengembangkan terapi yang lebih efektif. Sel kanker ini dapat diambil melalui biopsi atau reseksi jaringan, kemudian diolah menjadi suspensi sel tunggal dengan metode disosiasi enzimatik dan mekanik.

Pengobatan kanker pankreas, yang melibatkan sel kanker tersebut, meliputi kemoterapi, radioterapi, dan operasi, tergantung pada stadium dan kondisi pasien. Kemoterapi bertujuan membunuh sel kanker, radioterapi menghancurkan sel kanker dengan sinar berenergi tinggi, dan operasi mengangkat tumor bila memungkinkan

B. Isolasi Sel Tunggal dari Jaringan Kanker Pankreas

Mengisolasi sel tunggal dari jaringan kanker pankreas melibatkan protokol yang dioptimalkan dengan hati-hati yang menggabungkan disosiasi mekanis dan enzimatik, diikuti oleh langkah-langkah penyaringan dan pemurnian untuk mendapatkan suspensi sel tunggal yang layak untuk flow cytometry dan sekuensing RNA sel tunggal.

Gambar 1. Protokol Isolasi Sel Tunggal dari Jaringan Kanker Pankreas untuk Flow Cytometry
(Song et al., 2023)

Berikut adalah protokol umum untuk mengisolasi sel tunggal dari jaringan kanker pankreas manusia menggunakan flow cytometry, berdasarkan rangkuman dari beberapa sumber terpercaya yang memuat prosedur serupa:

1. Penyimpanan Sampel Jaringan
   Simpan jaringan dalam media dingin (misalnya PBS dingin atau medium khusus) untuk menjaga viabilitas sel.
2. Disosiasi Jaringan
   • Potong jaringan menjadi fragmen kecil (~1–2 mm³) menggunakan pisau bedah steril.
   • Inkubasi fragmen jaringan dalam larutan enzimatik yang mengandung kolagenase dan/atau dispase pada suhu 37°C selama 15–30 menit dengan agitasi ringan untuk memecah matriks ekstraseluler dan melepaskan sel individual.
   • Lakukan pipetasi mekanik secara perlahan untuk membantu disosiasi sel.

3. Penghentian Reaksi Enzimatik dan Penyaringan
   • Hentikan reaksi enzim dengan menambahkan medium yang mengandung serum atau larutan penghambat enzim.
   • Saring suspensi sel melalui saringan nylon 70 µm untuk menghilangkan sisa jaringan dan menghasilkan suspensi sel tunggal.

4. Penghilangan Sel Mati dan Sel Darah Merah

Jika terdapat sel mati atau eritrosit, lakukan lisis sel darah merah menggunakan larutan lisis khusus (ACK buffer) dan/atau gunakan kit penghilangan sel mati berbasis magnetic beads (MACS) untuk meningkatkan kualitas sampel

5. Penghitungan dan Penyesuaian Konsentrasi Sel
   • Hitung jumlah sel dan tentukan viabilitas menggunakan trypan blue atau pewarna vital lain.
   • Sesuaikan konsentrasi sel sekitar 1 x 10^6 sel/ml dalam PBS atau buffer staining.

6. Pewarnaan Sel dengan Antibodi Fluorokrom
   • Tambahkan antibodi monoklonal berlabel fluorokrom yang spesifik terhadap antigen permukaan atau intrasel yang diinginkan.
   • Inkubasi selama 20–30 menit pada suhu 4°C dalam gelap.
   • Jika target antigen intrasel, lakukan permeabilisasi membran sel sebelum pewarnaan.

7. Pencucian dan Resuspensi Sel
   • Cuci sel dengan buffer PBS untuk menghilangkan antibodi berlebih.
   • Resuspensi sel dalam buffer untuk analisis flow cytometry.

8. Analisis dan Sortasi Sel dengan Flow Cytometry
   • Jalankan sampel pada flow cytometer dengan pengaturan tekanan rendah dan nozzle besar (100–200 µm) untuk menjaga viabilitas sel.
   • Lakukan analisis dan/atau sortasi (FACS) untuk mengisolasi populasi sel tunggal berdasarkan ekspresi marker spesifik

Catatan Tambahan

• Proses isolasi harus dilakukan dengan cepat dan aseptik untuk menjaga viabilitas dan integritas antigen pada permukaan sel.
• Hindari penggunaan pengawet seperti formalin atau alkohol yang dapat merusak antigen dan mengganggu ikatan antibodi
• Waktu inkubasi enzim harus dimonitor secara ketat untuk menghindari kerusakan sel dan menurunnya viabilitas.
• Viabilitas sel yang diinginkan biasanya >80%.

Berikut merupakan produk dari merk Elabscience yang dapat digunakan untuk Isolasi Sel Tunggal dari Jaringan Kanker Pankreas dengan flow cytometry

Tabel 1. Produk Elabscience untuk Isolasi Sel Tunggal dari Jaringan Kanker Pankreas dengan flow cytometry

Referensi

1. Brouwer, T.P., Vries, N.L., Abdelaal. T., Krog, R.T., Li, Z., Ruano, D., Farina, A., Lelieveldt, B.P.F., Morreau, H., Bonsing, B.A., Vahrmeijer, A.L., Koning, F., Miranda, N.F.C.C. 2022. Local and Systemic Immune Profiles of Human Pancreatic Ductal Adenocarcinoma Revealed by Single-cell Mass Cytometry. J Immunother Cancer. 10(7):e004638.
2. Song, J., Junlei, Z., Yongtao, J., Jianghui, T., Jianpeng, S., Tingbo, L., Xueli, B. 2023. Protocol for Isolating Single Cells from Human Pancreatic Cancer Tissues and Analyzing Major Immune Cell Populations Using Flow Cytometry. STAR Protocols. 102679
3. Yosefov-Levi, O., Tornovsky, S., Parnas, O. 2023. Pancreatic Tissue Dissection to Isolate Viable Single Cells. Vis. Exp. (195), e64871.