A. PCR (Polymerase Chain Reaction)

Reaksi berantai polimerase pertama kali ditemukan pada tahun 1983 oleh Kary Mullis  sebagai teknik biologi molekuler. Prinsip fungsional PCR  adalah mereplikasi segmen spesifik materi genetik DNA. Proses ini dilakukan secara in vitro. PCR dilakukan dengan mencampur cetakan DNA, polimerase Taq, primer, dan deoksiribonukleosida trifosfat (dNTP). Tabung yang berisi campuran tersebut  diatur ke perubahan suhu dan diulang secara tepat dan cepat puluhan kali.

Amplifikasi DNA dalam PCR dapat dicapai dengan menggunakan primer oligonukleotida, yang disebut amplimer. Primer DNA adalah urutan oligonukleotida pendek yang berfungsi untuk memulai sintesis untaian DNA. PCR memungkinkan amplifikasi fragmen DNA. Secara umum, primer yang digunakan dalam PCR terdiri dari 20–30 nukleotida. Cetakan DNA adalah fragmen DNA yang diperkuat yang berasal dari patogen yang ditemukan dalam sampel klinis. Enzim polimerase DNA merupakan enzim  Taq stabil panas yang berasal dari bakteri termofilik Thermus aquaticus. Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP) mengikat ujung 3′ primer selama ekstensi, dan ion magnesium merangsang aktivasi polimerase.

B. JENIS-JENIS PCR

Teknik PCR memiliki berbagai macam jenis karena teknik ini dapat dimofikasi, jenis-jenis tersebut antara lain:

1. Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)
2. Inverse-PCR
3. Nested-PCR
4. Quantitative-PCR
5. Reverse Trajennscriptase (RT-PCR)
6. Random Amplified Polymorphic DNA ( RAPD )

C. TEKNIK PCR KONVENSIONAL

Terdapat tahapan penting yang dilakukan dalam proses PCR dan selalu berulang dalam 30-40 siklus yang sangat cepat:

1. Denaturasi

Proses PCR dimulai dengan denaturasi  sebelum enzim Taq polimerase ditambahkan ke tabung reaksi. Denaturasi DNA adalah proses mengubah DNA beruntai ganda menjadi DNA beruntai tunggal. Umumnya diperlukan waktu sekitar 3 menit agar molekul DNA terdenaturasi menjadi DNA untai tunggal. Denaturasi yang tidak sempurna menyebabkan DNA cepat mengalami  renaturasi (mereformasi DNA beruntai ganda) dan  proses PCR gagal. Waktu denaturasi yang terlalu lama dapat  mengurangi aktivitas enzim Taq polimerase. Aktivitas enzim pada suhu 92,5 derajat memiliki waktu paruh masing-masing 2 jam, 40 menit, dan 5 menit masing-masing pada suhu 92,5; 95 dan 97,5°C.

2. Annealing (Penempelan Primer)

Kriteria yang umum digunakan untuk merancang primer yang tepat adalah  bahwa primer harus berukuran 18-25 basa, mengandung 50-60% G+C, dan sama di kedua primer. Lebih jauh lagi, urutan DNA dari setiap primer itu sendiri  tidak boleh saling melengkapi, jika tidak, struktur sekunder akan terbentuk di dalam primer, yang akan mengurangi efisiensi PCR.  Waktu annealing yang umum digunakan dalam PCR adalah 30-45 detik.Semakin panjang ukuran primer, semakin tinggi suhunya. Kisaran suhu yang digunakan adalah 36°C hingga 72°C, tetapi suhu standar untuk  adalah 50°C hingga 60°C.

3. Extension (Pemanjangan Primer)

Pada tahap ini, polimerase Taq mulai bekerja dan memperluas primer DNA- dari ujung 3′-nya. Laju perakitan nukleotida enzimatik pada suhu 72 °C diperkirakan antara 35 dan 100 nukleotida/detik, tergantung pada penyangga, pH, konsentrasi garam, dan molekul DNA target. Untuk produk PCR  yang panjangnya 2000 pasangan basa, 1 menit cukup untuk langkah ekstensi primer ini. Biasanya, waktu yang digunakan untuk langkah ini diperpanjang hingga 5 menit pada akhir siklus PCR, dengan harapan bahwa semua produk PCR akan membentuk DNA untai ganda.

Gambar 1. Polymerase Chain Reaction (PCR)
Sumber:https://smkbanisaleh.sch.id/2020/03/29/polymerase-chain-reaction-pcr-atau-reaksi-berantai-polimerase/

Reaksi yang terjadi diulang 25 hingga 30 kali (siklus), dan pada akhir setiap siklus, jumlah molekul DNA untai ganda  baru  yang jauh lebih banyak diperoleh dibandingkan  dengan jumlah DNA cetakan yang digunakan. . Jumlah siklus amplifikasi bergantung pada konsentrasi DNA target dalam campuran reaksi. Produk PCR dapat dibedakan berdasarkan ukuran menggunakan  elektroforesis gel agarosa. Dalam metode ini, DNA dituangkan ke dalam gel  agarosa dan  gel tersebut dikombinasikan dengan listrik. Hasilnya, untaian DNA kecil bermigrasi dengan cepat dan untaian yang lebih besar memberikan hasil positif di seluruh gel.

D. PRODUK PCR KONVENSIONAL

Berikut ini terdapat produk yang digunakan saat melakukan PCR dari brand DAKEWE Biosci.

Tabel 1. Produk Enzim Restriksi Brand DAKEWE Biosci

Tabel 2. Produk Asam Nukleat untuk PCR  Brand DAKEWE Biosci

Untuk pertanyaan produk dan stok lebih lanjut Anda dapat menghubungi kami PT. INDOGEN INTERTAMA melalui email atau WhatsApp yang tertera pada web kami.

Referensi:

Endramaji, R.P. (2024). PENYUSUNAN E-LEAFLET HASIL PENELITIAN BIOPROSPEKSI BAKTERI ENDOFIT DARI ALGA HIJAU (Ulva lactuca) DI PANTAI GESING KABUPATEN GUNUNG KIDUL SEBAGAI PENGHASIL RASA UMAMI UNTUK MEDIA PEMBELAJARAN MATERI INOVASI TEKNOLOGI BIOLOGI KELAS X SMA. (Skripsi, Univeristas Ahmad Dahlan, 2024).

Yusuf, Z.K. (2010). POLYMERASE CHAIN REACTION (PCR). Saintek, 5(6).