Prinsip Kerja Western Blotting (WB) dan Komponen yang Dibutuhkan: Preparasi – Bagian 1
Western blotting (WB) atau protein immunoblotting merupakan teknik untuk mendeteksi protein spesifik dari sampel sel atau jaringan guna mencocokkan teknik serupa yang digunakan untuk deteksi DNA (Southern blotting) dan RNA (Northern blotting). WB memisahkan protein sesuai ukurannya dengan elektroforesis gel melalui transfer listrik protein ke membran yang diperiksa dengan antibodi terhadap protein target. Teknik ini sangat andal dalam mendeteksi keberadaan protein target dalam sampel, menilai modifikasi pasca-translasi (mis, fosforilasi) dan mengkarakterisasi kompleks protein. Meskipun terdapat beberapa variasi WB, protokol dapat dioptimalkan untuk aplikasi tertentu.
Persiapan Sampel
Lisis sel dari jaringan didahului oleh homogenisasi mekanis atau enzimatik, untuk mengekstraksi dan melarutkan protein. Bergantung pada struktur seluler (inti, sitoplasma, membran plasma, dll.) dan jenis sel (sel mamalia, bakteri, khamir, dll), buffer lisis berbeda disesuaikan dengan kebutuhan tersebut. Buffer lisis terdiri dari agen penyangga (mis, Tris-HCl), garam (mis, natrium klorida), deterjen anti-lipid, dan inhibitor protease (untuk mencegah degradasi protein).
| Komponen Western Blot | Brand | Katalog | Ukuran |
| Tris-HCL [(Tris (Hydroxymethyl) Aminomethane Hydrochloride] ≥99.5% CAS: 1185-53-1 | Solarbio | T8230 | 100g, 500g |
| Sodium chloride [NaCl] >99.9% CAS : 7647-14-5 | Solarbio | S8210 | 100g, 500g |
Berikut merupakan foto Tris-HCL yang berfungsi sebagai buffer atau agen penyangga yang dijual oleh PT INDOGEN WA. +62 812-9318-5185.
Gambar 1. Tris-HCL merk SolarBio
Deterjen
Deterjen ionik seperti natrium dodesil sulfat (SDS) adalah agen pelarut yang kuat tetapi dapat mendenaturasi protein dan menyebabkan peningkatan viskositas sampel akibat pelepasan kromatin. Detergen nonionik (mis, NP-40, Triton X-100, Triton X-114) dan zwitterionik (CHAPS) bersifat lembut dan tidak terlalu mendenaturasi.
| Komponen Western Blot | Brand | Katalog | Ukuran |
| Nonidet TM P40 Substitute (NP-40) CAS: 9016-45-9 | Solarbio | N8030 | 100mL |
| Triton X-114 98% CAS: 9036-19-5 | Solarbio | T8210 | 100mL, 500mL |
| CHAPS aka 3-[(3-cholamidopropyl)dimethyl- ammonio]-1-propanesulfonate 99% CAS: 75621-03-3 | Solarbio | C8390 | 1g, 5g |
Inhibitor
Lisis sel menyebabkan pelepasan protease dan fosfatase, sehingga sampel harus disimpan pada suhu 4°C dan inhibitor yang sesuai perlu digunakan. Inhibitor yang dapat digunakan seperti, EDTA/EGTA (menghambat metalloprotease), aprotinin (menghambat tripsin dan plasmin), leupeptin (menghambat protease lisosomal), pepstatin A (menghambat protease aspartic), PMSF, NaF dan Na3VO4.
| Komponen Western Blot | Brand | Katalog | Ukuran |
| RIPA Lysis Buffer (with PMSF and Na3VO4) (Strong) | Elabscience | E-BC-R327 | 50mL, 100mL |
| TAE [Tris Acetate-EDTA] Buffer, 50× | Solarbio | T1060 | 500mL, 10×500mL |
| Aprotinin from bovine lung CAS: 9087-70-1 | Solarbio | A8260 | 5mg |
| Leupeptin CAS: 103476-89-7 | Solarbio | L8110 | 5mg |
| Pepstatin A ≥75% CAS: 26305-03-3 | Solarbio | P8100 | 5mg |
| PMSF(100mM) CAS: 329-98-6 | Solarbio | P0100 | 10mL, 100mL |
| Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) ≥98% CAS: 329-98-6 | Solarbio | P8340 | 25g, 5g |
| Sodium orthovanadate (Na3VO4) ≥98% CAS: 13721-39-6 | Solarbio | G8460 | 25g |
PMSF sering digunakan sebagai inhibitor dalam protokol western blot. Berikut merupakan PMSF merk SolarBio yang dijual oleh PT INDOGEN.
Gambar 2. PMSF merk SolarBio
Pengukuran Konsentrasi Protein
Konsentrasi protein dalam lisat penting untuk diketahui guna mengontrol jumlah yang dimuat pada gel dan untuk memungkinkan perbandingan antar percobaan. Konsentrasi protein dapat diukur dengan metode Bradford, Lowry, atau asam bicinchoninic (BCA). Tetapi beberapa deterjen yang disebutkan sebelumnya umumnya tidak sesuai dengan metode pengukuran protein berikut, sehingga harus dicermati dan diperiksa sebelum digunakan.
| Komponen Western Blot | Brand | Katalog | Ukuran |
| Bradford Protein Colorimetric Assay Kit | Elabscience | E-BC-K168-M | 96T (Plate) |
| Bradford Protein Colorimetric Assay Kit | Elabscience | E-BC-K168-S | 100T |
| BCA Protein Colorimetric Assay Kit | Elabscience | E-BC-K318-M | 96T (Plate), 500T |
Pencampuran sampel dan loading buffer
Pencampuran sampel dengan loading buffer merupakan langkah akhir persiapan yang terdiri dari gliserol (meningkatkan densitas sampel untuk memfasilitasi pemuatan pada gel), pewarna (bromophenol atau Coomassie Blue), agen pereduksi ikatan disulfida (β-mercaptoethanol atau DTT), serta dalam kondisi denaturasi dengan SDS (atau LDS). Untuk memastikan denaturasi sempurna dari protein, sampel biasanya direbus pada suhu 95°C selama 5-10 menit. Perebusan lama dapat menyebabkan degradasi atau agregasi protein.
| Komponen Western Blot | Brand | Katalog | Ukuran |
| 5 × SDS Loading Buffer | Elabscience | E-BC-R288 | 5mL, 10mL |
| Electrophoresis Buffer (10 ×), Tris-Glycine SDS electrophoresis buffer | Elabscience | E-BC-R331 | 200mL, 500mL |
| Glycerol ≥99.0% CAS: 56-81-5 | Solarbio | G8190 | 500mL |
| Bromophenol Blue Sodium Salt CAS: 34725-61-6 | Solarbio | YS143500 | 25g, 100g |
| Coomassie Brilliant Blue G-250 CAS: 6104-58-1 | Solarbio | C8420 | 5g, 10g |
| β-Mercaptoethanol ≥99.0% CAS: 60-24-2 | Solarbio | M8210 | 100mL |
| DTT (1,4-Dithio-DL-threitol) 99% (titration method) CAS: 3483-12-3 | Solarbio | D8220 | 10g, 25g, 100g |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) Approx.95% CAS: 151-21-3 | Solarbio | S8010 | 500g, 100g |
Berikut merupakan SDS merk SolarBio yang dijual oleh PT INDOGEN. SDS ini digunakan dalam tahap akhir persiapan sampel yaitu pencampuran sample dan loading buffer.
Gambar 3. SDS sodium dodecyl sulfate merk SolarBio
Referensi:
1. Mahmood T, Yang PC. Western blot: technique, theory, and troubleshooting. N Am J Med Sci. 2012 Sep;4(9):429-34.
2. Kurien BT, Scofield RH. Western blotting: an introduction. Methods Mol Biol. 2015;1312:17-30.
3. Hnasko TS, Hnasko RM. The Western Blot. Methods Mol Biol. 2015;1318:87-96.
4. Gavini K, Parameshwaran K. Western Blot. 2023 Apr 14. In: Stat Pearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2023 Jan–.
5. Mishra M, Tiwari S, Gomes AV. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Rev Proteomics. 2017 Nov;14(11):1037-1053.
6. Jalali M, Saldanha FYL, Jalali M. 2017. Basic Science Methods for Clinical Researchers. Academic Press.
Artikel terkait:
1. Mengenal Western Blot Bersama Solarbio Life Science (Link)
2. Introduksi Flow Cytometer dan Prinsip Kerjanya [Link]
3. Bagaimana Memilih Antibodi untuk Flow Cytometry [Link]
4. Aplikasi Metode Flow Cytometry dan Perkembangan Jenis Assay [Link]
5. Prosedur Flow Cytometry dan Seleksi Jenis Antibodi Flow Cytometry [Link]
6. Introduksi Teknik Imunofluoresensi dengan Immunofluorescence Kit [Link]
7. Mengenal Praktek dan Prosedur Teknik Imunofluoresensi (IF) [Link]
8. IHC 1: Ready-to-Use Antibodies untuk IHC merk Elabscience® [Link]
9. IHC 2 : Panduan Imunohistokimia (IHK) untuk Preparat Paraffin [Link]
10. Memilih Antibodi Primer atau Sekunder [Link]