Teknik Transformasi Genetik pada Tanaman Bagian 1: Transformasi Tidak Langsung
Metode untuk memasukkan DNA baru ke dalam sel tumbuhan dapat dibagi menjadi dua kategori utama: pengiriman DNA tidak langsung dan langsung. Gen yang diinginkan dimasukkan ke dalam sel target melalui bakteri, biasanya Agrobacterium tumefaciens dan Agrobacterium rhizogenes (lebih jarang). Penggunaan virus tanaman untuk menyisipkan konstruksi genetik ke dalam tanaman mungkin dilakukan, namun teknik ini terbatas karena rentangan inang virus. Contohnya, cauliflower mosaic virus (CaMV) hanya menginfeksi kembang kol dan spesies yang berhubungan dekat. Keterbatasan lain dari vektor virus yaitu virus biasanya tidak ditularkan kepada keturunannya sehingga harus diinokulasi setiap kali.
Transformasi langsung memasukkan materi genetik tanpa inang perantara, misalnya transformasi biolistik dan transformasi protoplas. Penggunaan alat seperti marker molekuler atau DNA fingerprint dapat memetakan ribuan gen. Hal ini memungkinkan untuk menyaring populasi tanaman dalam jumlah besar untuk menemukan tanaman dengan sifat yang diinginkan. Skrining didasarkan pada ada tidaknya gen tertentu yang ditentukan melalui prosedur laboratorium, bukan berdasarkan identifikasi visual dari sifat yang diekspresikan pada tanaman.
A. Transformasi Tidak Langsung
Sebelum menggunakan metode transformasi tanaman jenis manapun, sumber DNA yang disebut kaset transgen perlu dirancang terlebih dahulu. Kaset transgen memungkinkan tanaman inang menghasilkan protein yang diinginkan. Kaset berisi semua elemen regulasi yang memungkinkan keberhasilan ekspresi gen asing dan juga membantu dalam seleksi tanaman hasil rekayasa genetika. Elemen-elemen tersebut antara lain:
- gen asing untuk ekspresi protein yang diinginkan,
- rangkaian promotor untuk inisiasi transkripsi pada situs yang tepat,
- rangkaian terminasi untuk menandai akhir rangkaian gen, dan
- gen marker untuk identifikasi jaringan tanaman yang mengekspresikan protein.
Mengintegrasikan gen asing ke dalam genom inti tanaman adalah teknik yang paling konvensional untuk memproduksi tanaman transgenik untuk sintesis protein rekombinan. Gen asing dalam vektor dapat ditransformasikan menjadi genom inti menggunakan metode Agrobacterium atau pemboman partikel (gene gun atau biolistik). Dari kumpulan galur transgenik stabil, hasil yang terbaik dipilih dan digunakan untuk produksi protein rekombinan selama beberapa generasi berturut-turut.
1.Teknik Berbasis Virus
Pemasukkan reagen rekayasa genom dapat dilakukan melalui vektor berbasis virus tanaman. Baik virus DNA (bean yellow dwarf virus, wheat dwarf virus, cabbage leaf curl virus) dan virus RNA (tobacco rattle virus) telah menunjukkan frekuensi penargetan gen yang efisien pada tanaman model (Nicotiana benthamiana) dan tanaman pangan (kentang, tomat, padi, gandum dan lainnya). Sistem ini sangat berguna terutama pada tanaman yang memiliki nilai ekonomi penting. Vektor virus memiliki signifikansi penting baik DNA maupun RNA dalam rekayasa genom tanaman.
2.Transformasi Gen Dimediasi Agrobacterium
Agrobacterium tumefaciens adalah bakteri tanah umumnya menyebabkan pembentukan puru (gall) pada berbagai spesies tanaman, termasuk sebagian besar spesies dikotil dan beberapa monokotil. Puru diinduksi oleh transfer gen penghasil hormon dari sel bakteri ke dalam genom tanaman. Gen tersebut dibawa pada molekul DNA sirkuler (cDNA) yang ditemukan di dalam sel bakteri yang disebut plasmid Ti (tumor-inducing). Selama proses infeksi, hanya sebagian dari plasmid Ti (dikenal sebagai T-DNA) yang ditransfer ke tanaman. Proses infeksi dan transfer T-DNA A. tumefaciens telah dipelajari secara ekstensif. Proses alami ini telah digunakan untuk memfasilitasi modifikasi genetik tanaman.
Gambar 1. Plasmid Ti pada Agrobacterium.
Plasmid Ti A. tumefaciens telah diproduksi tidak memiliki gen yang bertanggung jawab untuk pembentukan puru (disarmed plasmid). Gen target dimasukkan ke dalam bagian T-DNA dari disarmed plasmid tersebut. Sel A. tumefaciens dengan plasmid tersebut tidak dapat menghasilkan puru pada tanaman yang diinfeksi, tetapi akan mentransfer rangkaian T-DNA yang membawa gen target ke dalam sel tanaman sehingga gen tersebut berintegrasi secara stabil ke dalam genom tanaman.
Saat ini, sistem biner T-DNA artificial di mana gen T-DNA dan vir berlokasi pada biner replikon (T-DNA) yang terpisah sudah dikembangkan. Sistem ini terdiri dari plasmid biner dan plasmid helper (disarmed plasmid) yang bersama-sama menghasilkan tanaman hasil rekayasa genetika. Vektor biner mengandung dua sumber replikasi yang mengarah pada replikasi pada host E. coli dan Agrobacterium tumefaciens. Selain itu, resistensi antibiotik pada vektor biner membantu menyeleksi keberadaan vektor biner pada bakteri.
Transformasi dengan Agrobacterium dapat dicapai dengan menggunakan berbagai jaringan tanaman termasuk protoplas (yaitu sel diisolasi yang dinding sel telah dihilangkan) dan disk daun. Jaringan tanaman diinkubasi dengan bakteri selama jangka waktu tertentu dan bervariasi untuk memungkinkan terjadinya infeksi, dan kemudian dipindahkan ke media sintetis mengandung nutrisi dan hormon pertumbuhan tanaman dari sel tunggal tertransformasi, serta agen selektif seperti antibiotik untuk menghilangkan sel-sel yang tidak ditransformasi. Selama proses regenerasi ini, sel-sel tertransformasi biasanya membelah untuk membentuk suatu massa jaringan yang disebut callus sebelum pembentukan planlet. Terlepas dari proses transformasi yang dimediasi Agrobacterium, regenerasi callus tersebut dapat menyebabkan mutasi atau perubahan lain pada genom sel tanaman yang dikenal sebagai variasi somaklonal.
Sebagai alternatif, suatu metode transformasi dimediasi Agrobacterium menggunakan seluruh tanaman telah dikembangkan, seperti infiltrasi vakum dan floral dip. Metode ini meminimalkan variasi somaklonal dan menghasilkan keturunan yang lebih seragam secara genetik. Untuk metode floral dip, bunga dicelupkan ke dalam kultur Agrobacterium dan bakteri tersebut mentransformasi sel germline pembentuk gamet betina. Benih dari tanaman ini ditanam dan skrining untuk modifikasi genetik, misalnya menggunakan marker resistensi antibiotik atau toleransi herbisida.
Untuk tanaman ditransformasi melalui Agrobacterium, bakteri residu dalam beberapa kasus mampu bertahan melalui proses transformasi dan tetap berada dalam tanaman GM (genetically modified). Agrobacteria biasanya tereliminasi saat tanaman GM ditanam dari benih, namun beberapa pada tanaman yang diperbanyak secara vegetatif bisa tidak tereliminasi. Dengan demikian, hal ini memunculkan potensi Agrobacteria GM untuk mentransfer gen ke bakteri lain atau mikroba lainnya. Karena alasan ini, teknik transformasi ini mencakup metode ketat untuk mencegah kebertahanan Agrobacteria dan juga menyingkirkan tanaman GM yang masih mengandung Agrobacteria demi meminimalkan potensi transfer gen di lingkungan.
Sejak penerapan transformasi dimediasi Agrobacterium pada spesies dikotil, monokotil (padi, jagung, barley, tebu, gandum) dan sel hewan, penggunaan Agrobacterium masih menjadi fokus utama dalam transformasi. Ciri-ciri utama sistem Agrobacterium pada spesies tersebut, antara lain 1) frekuensi transformasi cukup tinggi, serta 2) integrasi tepat gen asing ke dalam genom host dan jumlah salinan gen rendah.
Tabel 1. Agrobacterium untuk transformasi genetik tanaman dari BNCC.
| Katalog | Deskripsi | Jenis | Format |
| BNCC180854 | Agrobacterium tumefaciens | Plant genetic engineering bacteria | freeze dried |
| BNCC356354 | Agrobacterium tumefaciens AGL1 | Plant genetic engineering bacteria | freeze dried |
| BNCC356378 | EHA105 Agrobacterium | Competent Cells – Plant genetic | freeze dried |
| BNCC356379 | EHA105 (pSoup) Agrobacterium | Plasmid | freeze dried |
| BNCC356380 | EHA101 Agrobacterium | Competent Cells – Plant genetic | freeze dried |
| BNCC357903 | GV3101 Agrobacterium | Competent Cells – Plant genetic | freeze dried |
| BNCC357904 | GV3101 (pJIC SA-rep) Agrobacterium | Plasmid | freeze dried |
| BNCC357905 | GV3101 (pSoup) Agrobacterium | Plasmid | freeze dried |
| BNCC357907 | GV3101 (pSoup-19) Agrobacterium | Plasmid | freeze dried |
| BNCC357913 | Agrobacterium LBA4404 | Competent Cells – Plant genetic | freeze dried |
3.Mekanisme Transfer Gen Dimediasi Agrobacterium tumefaciens
Proses transfer gen dari Agrobacterium tumefaciens ke dalam sel tanaman dapat dilakukan melalui beberapa langkah:
(1) infestasi bakteri
(2) induksi gen virulensi bakteri
(3) pembentukan kompleks transfer T-DNA
(4) integrasi kompleks T-DNA ke dalam genom tanaman
Polisakarida pada permukaan sel A. tumefaciens diperkirakan berperan penting dalam kolonisasi dan selama interaksi dengan tanaman host. Gen yang bertanggung jawab atas keberhasilan perlekatan bakteri pada sel tumbuhan terletak pada lokus 20 kb kromosom.
Lipopolisakarida (LPS) merupakan bagian integral dari membran luar yang mencakup anchor membran lipid dan polisakarida antigen. A. tumefaciens juga menghasilkan polisakarida kapsuler (antigen) yang tidak memiliki jangkar lipid, bersifat anionik kuat dan berasosiasi kuat dengan sel. Beberapa bukti menunjukkan bahwa polisakarida kapsuler mungkin memiliki peran tertentu selama interaksi dengan tanaman host. Dalam kasus khusus A. tumefaciens, perlekatan langsung bakteri wild-type ke sel tanaman telah diamati. Lokasi perlekatan ini terdiri dari setidaknya enam operon esensial (virA, virB, virC, virD, virE, virG) dan dua operon non-esensial (virF, virH). Jumlah gen setiap operon berbeda-beda.
Selain faktor internal, aktivasi sistem vir juga bergantung pada faktor eksternal seperti suhu dan pH. Kapasitas virulensi berkurang pada suhu tinggi (melebihi 32 C), karena perubahan konformasi lipatan VirA. Hal ini menunjukkan bahwa suhu untuk kultur bersama sangat penting untuk transformasi genetik dimana harus antara 21 dan 28 C. Aktivasi gen vir menghasilkan generasi molekul beruntai tunggal (ss) yang mewakili salinan untai T-DNA bagian bawah. Setiap DNA yang ditempatkan di antara batas T-DNA akan ditransfer ke sel tumbuhan sebagai ssDNA dan diintegrasikan ke dalam genom tanaman.
Langkah terakhir transfer T-DNA adalah integrasinya ke dalam genom tanaman. Mekanisme integrasi T-DNA belum sepenuhnya terjelaskan. Perlu dipertimbangkan bahwa integrasi terjadi melalui beberapa rekombinasi yang tidak sah. Berdasarkan model ini, pairing beberapa basa yang dikenal sebagai mikrohomologi, diperlukan untuk langkah pre- annealing antara untai T-DNA yang digabungkan dengan VirD2 dan DNA tanaman.
Tabel 2. Produk plasmid dan sel kompeten untuk transformasi genetik tanaman dari BNCC.
| Katalog | Deskripsi | Jenis | Format |
| BNCC356355 | AGL1(pSoup)Chemically Competent Cell | Competent Cell | freeze dried |
| BNCC356362 | B834(DE3) E. coli | Plasmid | freeze dried |
| BNCC356363 | BJ5183 Chemically Competent Cell | Competent Cell | freeze dried |
| BNCC356364 | BJ5183-AD-1 Chemically Competent Cell | Competent Cell | freeze dried |
| BNCC356366 | BL21 (AI) E. coli | Plasmid | freeze dried |
| BNCC356365 | BL21 Chemically Competent Cell | Competent Cell | freeze dried |
| BNCC356365 | BL21 Chemically Competent Cell | Competent Cell | freeze dried |
| BNCC359570 | BL21 CodonPlus (DE3)-RIPL | Plasmid | freeze dried |
| BNCC341576 | BL21 Escherichia coli expression strain | Plasmid | freeze dried |
| BNCC356367 | BL21 Star(DE3) E. coli | Plasmid | freeze dried |
| BNCC356369 | BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL Chemically Competent Cell | Competent Cell | freeze dried |
| BNCC356369 | BL21-CodonPlus (DE3)-RIPL Chemically Competent Cell | Competent Cell | freeze dried |
| BNCC356368 | BL21-Star(DE3)pLysS Escherichia coli | Plasmid | freeze dried |
| BNCC353806 | BL21(DE3) E. coli | Plasmid | penicillin bottle |
| BNCC353807 | BL21(DE3)pLysS E. coli | Plasmid | penicillin bottle |
| BNCC356373 | C43(DE3)pLysS Chemically Competent Cell | Competent Cell | freeze dried |
| BNCC356373 | C43(DE3)pLysS Chemically Competent Cell | Competent Cell | freeze dried |
| BNCC356373 | C43(DE3)pLysS Chemically Competent Cell | Competent Cell | freeze dried |
| BNCC356374 | C58C1 Chemically Competent Cell | Competent Cell | freeze dried |
| BNCC354652 | Escherichia coli BL21(DE3) (pET-32a(+)-NSP7) | Plasmid | penicillin bottle |
| BNCC354668 | Escherichia coli BL21(DE3) (pET-32a(+)-ORF10) | Plasmid | penicillin bottle |
| BNCC354662 | Escherichia coli BL21(DE3) (pET-32a(+)-ORF6) | Plasmid | penicillin bottle |
| BNCC354681 | Escherichia coli BL21(DE3)(pET-32a(+)-E-protein) | Plasmid | penicillin bottle |
| BNCC354647 | Escherichia coli BL21(DE3)(pET-32a(+)-NSP1) | Plasmid | penicillin bottle |
| BNCC354651 | Escherichia coli BL21(DE3)(pET-32a(+)-NSP1) | Plasmid | penicillin bottle |
| BNCC354656 | Escherichia coli BL21(DE3)(pET-32a(+)-NSP10) | Plasmid | penicillin bottle |
| BNCC354658 | Escherichia coli BL21(DE3)(pET-32a(+)-NSP16) | Plasmid | penicillin bottle |
| BNCC354654 | Escherichia coli BL21(DE3)(pET-32a(+)-NSP8) | Plasmid | penicillin bottle |
| BNCC354660 | Escherichia coli BL21(DE3)(pET-32a(+)-ORF3A) | Plasmid | penicillin bottle |
| BNCC354664 | Escherichia coli BL21(DE3)(pET-32a(+)-ORF7A) | Plasmid | penicillin bottle |
| BNCC354666 | Escherichia coli BL21(DE3)(pET-32a(+)-ORF8) | Plasmid | penicillin bottle |
| BNCC354684 | Escherichia coli BL21(DE3)(pET-32a(+)-Proteinase_3CL-pro) | Plasmid | penicillin bottle |
| BNCC358924 | Escherichia coli C43(DE3) | Plasmid | freeze dried |
| BNCC357921 | Escherichia coli expresses host bacteria Rosetta 2(DE3) | Plasmid | freeze dried |
| BNCC360455 | Escherichia coli Origami 2 (DE3) | Plasmid | freeze dried |
| BNCC341754 | Escherichia coli Rosetta(DE3) Strain | Plasmid | freeze dried |
| BNCC357908 | HT115(DE3) E. coli | Plasmid | freeze dried |
| BNCC341823 | JM109(DE3) E. coli | Plasmid | freeze dried |
| BNCC357914 | M15(pREP4) E. coli | Plasmid | freeze dried |
| BNCC357925 | Rosetta-gami(DE3)pLysS | Plasmid | freeze dried |
| BNCC357925 | Rosetta-gami(DE3)pLysS | Plasmid | freeze dried |
| BNCC357922 | Rosetta(DE3) Escherichia coli | Plasmid | freeze dried |
| BNCC357932 | Tuner(DE3) Escherichia coli | Plasmid | freeze dried |
Referensi:
- Karl-Hermann Kumar, Ashwani Imani, Jafargholi Neumann. 2020. Plant Cell And Tissue Culture: A Tool In Biotechnology: Basics And Application. Springer Nature.
- Kaiser Iqbal Wani, Tariq Aftab. 2022. Plant Molecular Farming: Applications and New Directions. SpringerBriefs in Plant Science. Springer.
Artikel Terkait:
- Indikator-Indikator Senyawa Pada Kejadian Stres Tanaman [link]
- Assay Kit Untuk Industri Sereal dan Dietary Fiber dari Megazyme [link]
- Fitokimia: Ekstraksi, Isolasi dan Identifikasi Senyawa Bioaktif Ekstrak Tanaman [link]
- Fitokimia Bagian 2: Ekstraksi, Isolasi dan Identifikasi Senyawa Bioaktif Ekstrak Tanaman [link]
- 6 Metode Deteksi Protein Yang Paling Umum Digunakan [link]
- 3 Metode Deteksi Protein dari Merk Elabscience [link]
- Isolasi dan Purifikasi Protein dengan Kit Komersial [link]