Uji Biokimia

Kami telah mengulas biochemical kit best seller no 1 hingga no 5 pada artikel sebelumnya. Kini kami akan mengulas 5 biochemical assay kit sisanya yaitu Potassium Assay kit, Nitric Oxide Assay kit, Triglyceride Assay kit, Total Glutathione (T-GSH/Oxidized (GSSG) Assay kit dan Alanine Aminotransferase (ALT/GPT) assay kit.

• Potassium (K) Turbidimetric

Potassium merupakan kation intraseluler utama. Sembilan puluh persen dari total potassium pada darah dalam keadaan bebas dan dapat berubah, sedangkan sisanya terikat dalam darah merah, tulang dan jaringan otak. Namun, hanya sekira 2 persen (50-60 mmol) dari keseluruhan yang berada dalam cairan ekstraseluler, di mana inilah potassium yang akan diukur. Konsentrasi potasium dalam plasma dikendalikan oleh ginjal. K + yang disaring di glomerulus diserap kembali di tubulus proksimal. Tubulus distal mengatur jumlah yang diekskresikan dalam urin. Ekskresi kalium dirangsang oleh aldosteron, tetapi juga tergantung pada laju filtrasi glomerulus, konsentrasi ion hidrogen ekstraseluler, ekskresi natrium dan air.

Pengukuran kalium digunakan dalam diagnosis dan pengobatan hipokalemia (konsumsi kronis diuretik dan pencahar, dengan atau tanpa gangguan keseimbangan asam-basa), hiperkalemia (pemberian kalium yang berlebihan, asidosis atau cedera), gagal ginjal, penyakit Addison`s atau penyakit lainnya yang berkaitan dengan ketidakseimbangan elektrolit.

Penggunaan natrium tetrafenilborat (TPB) sebagai reagen analitik untuk kalium diperkenalkan pertama kali oleh Wittig dkk sekitar lima puluh tahun yang lalu. Anehnya, metode turbidimetri untuk penentuan potassium ini dikembangkan dan digunakan secara memadai hanya empat puluh tahun kemudian. Metode ini diadaptasi untuk sistem injeksi aliran dan digunakan untuk penentuan kalium dan amonium dalam berbagai matriks.

Di bawah kondisi basa, natrium tetrafenilborat bereaksi dengan ion kalium dalam sampel untuk membentuk kalium tetrafenilborat yang berwarna putih dan partikel kecil dengan kelarutan kecil. Partikel kalium tetrafenilborat berada dalam keadaan suspensi yang stabil dalam larutan. Kekeruhan sebanding dengan konsentrasi ion kalium dalam sampel dan kandungan kalium dapat dihitung secara tidak langsung dengan mengukur nilai OD pada panjang gelombang 450 nm.

• Nitric Oxide (NO) 

Nitric oxide (NO) adalah radikal reaktif yang memainkan peran penting dalam banyak fungsi fisiologis utama misalnya saja dalam transmisi saraf, regulasi vaskular, respons imun, dan apoptosis. NO, produk oksidasi arginin oleh enzim sintase oksida nitrat, terlibat dalam pertahanan dan pengembangan inang, aktivasi protein pengatur dan interaksi kovalen langsung dengan biomolekul fungsional.

NO mudah teroksidasi untuk membentuk NO2- in vivo atau dalam larutan air, dan senyawa azo yang berwarna kemerahan terbentuk dengan zat pembentuk warna dan konsentrasi senyawa azo secara linier berhubungan dengan konsentrasi NO pada sampel. Konsentrasi NO dapat dihitung secara tidak langsung dengan mengukur nilai OD pada panjang gelobang 550 nm.

Gambar 1. Reaksi NO menjadi NO2-

Berikut merupakan daftar 10 Biochemical kit best seller dari Elabscience yang dijual oleh PT INDOGEN

Anda dapat mengunduh brosur Biochemical kit dari Elabscience di sini atau mengunduh manual biochemical kit pada laman ini.

• Triglyceride (TG) 

Trigliserida adalah lipid yang tidak larut dalam air yang terdiri dari tiga asam lemak yang diesterifikasi ke tulang punggung gliserol. Trigliserida diangkut dalam darah sebagai konstituen inti dari semua lipoprotein, tetapi merupakan komponen utama silomikron kaya trigliserida dan lipoprotein densitas sangat rendah (VLDL; very low-density lipoprotein). 

Sumber utama trigliserida adalah dari lemak makanan. Lemak makanan dihidrolisis di usus menjadi asam lemak bebas dan mono- dan digliserida dan kemudian diangkut melalui vili usus. Setelah diabsorpsi melalui usus, mereka disintesis ulang menjadi trigliserida baru dan dirakit menjadi silomikron. Trigliserida dengan cepat dihidrolisis di lapisan kapiler oleh lipoprotein lipase, melepaskan gliserol dan asam lemak bebas, yang diserap oleh jaringan adiposa untuk disimpan. Bila diperlukan, enzim lipase menghidrolisis trigliserida dari jaringan adiposa menjadi asam lemak dan gliserol, yang masuk ke aliran darah. Asam lemak dioksidasi di mitokondria dan peroksisom untuk menghasilkan energi. 

Trigliserida memainkan peran penting dalam metabolisme dengan mengandung energi lebih dari dua kali lipat daripada karbohidrat dan protein. Kadar TG dalam darah yang tinggi berimplikasi pada aterosklerosis, penyakit jantung dan stroke serta pada pankreatitis. 

Pengukuran kadar trigliserida berguna dalam diagnosis hiperlipoproteinemia primer dan sekunder, dislipidemia, dan trigliseridemia. Konsentrasi trigliserida juga berguna dalam diagnosis dan pengobatan diabetes melitus, nefrosis, obstruksi hati, dan penyakit lain yang melibatkan metabolisme lipid atau berbagai gangguan endokrin. Metode yang paling umum untuk menentukan konsentrasi trigliserida adalah dengan hidrolisis enzimatik dari trigliserida menjadi gliserol dan asam lemak bebas diikuti dengan pengukuran kolorimetri atau fluorometri dari gliserol yang dilepaskan.

Kedalaman warna kuinon yang dihasilkan berbanding lurus dengan kandungan trigliserida. Nilai absorbansi dari tabung standar dan tabung sampel diukur masing-masing dan kemudian kandungan trigliserida dalam sampel dapat dihitung.

Gambar 2.  Reaksi konversi TG oleh Lipase menjadi gliserol dan asam lemak

• Total Glutathione (T-GSH)/Oxidized Glutathione (GSSG) 

Stres oksidatif adalah salah satu aspek dari banyak penyakit, seperti penyakit paru-paru kronis (misalnya, asma, penyakit paru obstruktif kronik, kanker paru-paru, fibrosis idiopatik dan fibrosis kistik), penyakit / gangguan kardiovaskular (seperti aterosklerosis dan infark miokard), gangguan neurodegeneratif, rheumatoid arthritis/RA, amyotrophic lateral sclerosis dan diabetes dan baru-baru ini dilaporkan terlibat dalam AIDS. Glutathione (GSH) adalah antioksidan tripeptida tiol (γ-glutamyl cysteinyl glycine) yang penting dan konsentrasi intraselulernya merupakan indikator stres oksidatif. Di dalam sel, GSH ada dalam dua bentuk berbeda: bentuk reduksi sulfhidril (GSH) dan glutathione disulfide (GSSG), bentuk teroksidasi.

Stres oksidatif memiliki efek yang sangat besar pada keseimbangan tiol seluler dan dapat menyebabkan penurunan rasio GSH / GSSG di banyak organ tubuh. Spesies oksigen reaktif (ROS) —superoxide anion (O2 .–), radikal hidroksil (. OH), hidrogen peroksida (H2O2) dan hidroperoksida (R – OOH) —xenobiotik dan radikal organik lainnya dinetralkan oleh GSH melalui rangkaian mekanisme detoksifikasi yang melibatkan glutathione peroksidase (GPx), glutathione-S-transferases (GST) dan glutathione reductase (GR). Selain itu, GSH juga mengambil bagian dalam transduksi sinyal, ekspresi gen, apoptosis dan inang reaksi seluler lainnya. Oleh karena itu, status GSH / GSSG sering diukur dalam kondisi fisiologis dan patofisiologis.

Berbagai metode telah dirancang untuk penentuan glutathione dalam sampel biologis. Metode yang digunakan dapat dikategorikan ke dalam dua metode yaitu metode berbasis spektrofotometri dan kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC). Metode  spektrofotometri lebih populer karena lebih sederhana dengan sensitivitas cukup tinggi. Metode ini menggunakan 5,5′-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB), yang disebut juga sebagai ‘uji daur ulang’ dan glutathione S-transferase 1-chloro-2,4 -dinitrobenzene (CDNB), metode titik akhir. 

Uji daur ulang menggunakan spesifisitas GR untuk penentuan spektrofotometri glutathione total (GSH + GSSG), metode GST-CDNB hanya mengukur GSH, dengan lebih presisi tetapi kurang sensitif dibandingkan uji daur ulang. Metode titik akhir GSSG berbasis spektrofotometri juga populer dan pada dasarnya didasarkan pada pengukuran konsumsi NADPH oleh GR, suatu proses yang mengurangi keberadaan GSSG dalam sampel. Metode ini, serupa dengan semua metode titik akhir lainnya, cukup baik tetapi kurang sensitif; dua kali lipat kurang sensitif dibandingkan uji daur ulang GSH.

GSSG direduksi menjadi GSH oleh glutathione reductase, dan GSH dapat bereaksi dengan DTNB untuk menghasilkan GSSG dan TNB kuning. Jumlah glutathione total (GSSG + GSH) menentukan jumlah TNB kuning. Jadi total glutathione dapat dihitung dengan mengukur nilai OD pada 412 nm. Kandungan GSSG dapat ditentukan dengan terlebih dahulu menghilangkan GSH dari sampel dengan reagen yang sesuai dan kemudian menggunakan prinsip reaksi di atas.

Gambar 3. Reduksi GSSG menjadi GSH oleh glutathione reductase

• Alanine Aminotransferase (ALT/GPT)

Aspartate aminotransferase (AST, EC 2.6.1.1) dan alanine aminotransferase (ALT, EC 2.6.1.2) adalah enzim yang ditemukan terutama di hati, tetapi juga ditemukan di sel darah merah, sel jantung, jaringan otot, dan organ lain, seperti pankreas. dan ginjal. AST dan ALT sebelumnya masing-masing disebut serum glutamic oxaloacetic transaminase (GOT) dan serum glutamic pyruvic transaminase (GPT). 

Kadar SGOT atau ALT adalah informasi berharga terutama dalam diagnosis penyakit hati. Meskipun tidak spesifik untuk penyakit hati, ia dapat digunakan dalam kombinasi dengan enzim lain untuk memantau jalannya berbagai gangguan hati. Konsentrasi normal dalam darah adalah dari 5 sampai 40 U l-1 untuk AST dan dari 5 sampai 35 U l-1 untuk ALT. Namun, ketika jaringan tubuh atau organ seperti hati atau jantung sakit atau rusak, AST dan ALT tambahan dilepaskan ke dalam aliran darah, menyebabkan peningkatan kadar enzim. Oleh karena itu, jumlah AST dan ALT dalam darah berhubungan langsung dengan tingkat kerusakan jaringan. 

ALT mengkatalisis reaksi konversi amino antara alanin dan asam α-ketoglutarat untuk menghasilkan asam piruvat dan asam glutamat pada pH 7,4 dan 37 ℃. Kemudian fenilhidrazin ditambahkan untuk membentuk fenilhidrazon dengan asam piruvat. Fenilhidrazon berwarna coklat kemerahan dalam kondisi basa. Aktivitas ALT dapat dihitung dengan mengukur nilai OD pada panjang gelombang 510 nm.Setelah kerusakan parah, level AST naik 10 hingga 20 kali dan lebih besar dari biasanya, sedangkan ALT dapat mencapai level yang lebih tinggi (hingga 50 kali lebih besar dari biasanya). Di sisi lain, rasio AST terhadap ALT (AST / ALT) terkadang dapat membantu menentukan apakah hati atau organ lain telah rusak.

α-ketoglutarate + alanine ⇌ glutamate + pyruvate

Gambar 4. Reaksi Konversi dengan enzim ALT

Sumber:

• Tubino, M dkk. 2004. Rapid Quantitative Turbidimetric Spot Test Analysis of Potassium In Blood Serum. Journal of the Brazilian Chemical Society. 
• Rahman, I dkk. 2006. Assay for quantitative determination of glutathione and glutathione disulfide levels using enzymatic recycling method. Nature Protocol. USA.
• Giustarini, D dkk. 2016. Pitfalls in the analysis of the physiological antioxidant glutathione (GSH) and its disulfide (GSSG) in biological samples: An elephant in the room. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci.
• Huang, XJ dkk. 2006. Aspartate Aminotransferase (AST/GOT) and Alanine Aminotransferase (ALT/GPT) Detection Techniques. Journal Sensors.