A. Kuantitasi Protein

Kuantitasi protein merupakan bagian tidak terpisahkan dari alur kerja di laboratorium dan sering menjadi pilihan penting sebelum isolasi, separasi dan analisis dengan kromatografi, elektroforesis atau teknik imunokimia. 

Setiap pengujian protein memiliki keterbatasan, tergantung dengan aplikasi dan sampel protein spesifik yang akan diuji. Hal yang perlu dipertimbangkan dalam pengujian protein diantaranya, sensitivitas, kompatibilitas substansi dalam sampel (seperti, deterjen, agen reduksi, agen chaotropic, inhibitor, bermacam garam dan buffer), linearitas kurva standar dan variasi protein-ke-protein. Elabscience memberikan solusi dengan menawarkan berbagai pengujian untuk mendeteksi total protein secara kuantitatif dengan teknik kolorimetri.

Kuantitasi protein paling sering menggunakan metode kolorimetri. Metode kolorimetri untuk mengetahui konsentrasi protein yaitu, menggunakan metode pengikatan warna dengan Coomassie blue G-250, metode biuret, metode Lowry, metode bicinchoninic acid (BCA) dan dengan metode colloidal gold protein. Dari ke 5 metode tersebut, yang paling umum digunakan yaitu dengan metode Coomassie/Bradford dan Biuret/BCA.

B. Metode Deteksi Protein

• Metode BCA

Prinsip Kerja

Prinsip kerja dari metode BCA yaitu mereduksi Cu2+ menjadi Cu1+ oleh protein dalam medium basa dengan deteksi kolorimetri sangat sensitif dan selektif dari kation cuprous (Cu1+) oleh asam bikininat (BCA).

Gambar 1. Reaksi Kimia Metode BCA

Tahap pertama merupakan chelating tembaga dengan protein dalam lingkungan basa akan membentuk kompleks biru muda. Reaksi ini dikenal sebagai reaksi biuret, dimana peptida yang mengandung tiga atau lebih residu asam amino membentuk kompleks kelat (chelate) berwarna dengan ion cupric dalam lingkungan basa yang mengandung natrium kalium tartrat.

Tahap kedua yaitu reaksi pembentukan warna, BCA bereaksi dengan kation tereduksi (cuprous) yang terbentuk pada tahap pertama. Hasil reaksi akan terbentuk warna ungu kuat, yang merupakan hasil chelating dua molekul BCA dan satu tembaga. BCA maupun tembaga dapat larut dalam air dan menunjukan penyerapan yang kuat dengan panjang gelombang 562 nm dengan peningkatan konsentrasi protein. Kompleks ini 100 kali lebih sensitif (deteksi batas terendah) dibandingkan dengan warna biru pucat pertama reaksi.

Kelebihan Metode BCA

1. Metode mudah dan sensitivitas tinggi
2. Banyak jenis sampel yang dapat diuji
3. Memiliki akurat tinggi dan linearitas yang baik

Kekurangan Metode BCA

1. Dipengaruhi oleh agen chelating dan konsentrasi zat pereduksi yang sedikit lebih tinggi

• Metode Biuret

Prinsip Kerja

Ikatan peptida protein bereaksi dengan kompleks ion cupric (Cu2+) dalam larutan basa membentuk produk berwarna ungu dan terbaca dengan panjang gelombang 540 nm.

Gambar 2. Reaksi Metode Biuret

Kelebihan dari metode biuret

1. Tidak terpengaruh dengan suhu, warna yang dihasilkan sama pada protein yang berbeda.
2. Pengulangan baik
3. Memiliki akurasi tinggi

Kekurangan metode biuret

1. Kurang sensitif
2. Banyak gangguan dari agen chelating maupun agen reduksi

• Metode Bradford

Prinsip Kerja

Coomassie brilliant blue G-250 akan berikatan dengan protein dalam lingkungan asam mengubah warna dasar Coomassie brilliant blue G-250 yaitu merah menjadi warna biru pada panjang gelombang maksimal 595 nm. 

Gambar 3. Reaksi Metode Bradford

Kelebihan Metode Bradford

1. Memiliki sensitivitas tinggi
2. Mudah dan cepat, warna stabil
3. Relatif tidak ada gangguan dari substansi seperti EDTA, gula dll

Kekurangan Metode Bradford

1. Deviasinya luas terhadap sampel protein yang berbeda
2. Masih terdapat beberapa gangguan, seperti gliserol, asam asetat, deterjen, dan larutan basa

Berikut merupakan daftar kit untuk deteksi protein yang dijual oleh PT INDOGEN :

Sumber

https://file.elabscience.com/documents/biochemical_protein.pdf 

https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/BID/Application-Notes/rapid-sensitive-protein-assay-white-paper.pdf

https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/protein-assay-technical-handook.pdf

https://onelab.andrewalliance.com/library/bca-colorimetric-protein-assay-X5nPg0gP