4 Metode Mengukur Proliferasi Sel

Proliferasi adalah fase sel saat mengalami pengulangan siklus sel tanpa hambatan. Istilah proliferasi sel secara khusus berlaku untuk peningkatan jumlah sel, yang diukur sebagai jumlah sel sebagai fungsi waktu.

Baca juga artikel mengenai 4 Alasan Memilih Kit Cell Proliferation and Toxicity Merk Elabscience di sini

Tes proliferasi sel digunakan dalam berbagai aplikasi penelitian ilmiah – dari pengujian obat hingga efek faktor pertumbuhan, dari pengujian sitotoksisitas hingga analisis aktivitas sel. Jadi tes proliferasi sel adalah tes yang mendeteksi perubahan dalam jumlah sel dalam suatu divisi atau perubahan dalam populasi sel.

Assay proliferasi sel dibagi menjadi empat metode yaitu : assay aktivitas metabolik, assay penanda proliferasi sel, tes konsentrasi ATP dan uji sintesis DNA. Metode yang dipilih tergantung pada jenis sel yang dipelajari, protokol penelitian dan jenis informasi yang ingin Anda peroleh dari pengujian proliferasi sel tersebut.

1.  Aktivitas Metabolik

Mendeteksi aktivitas metabolisme populasi sel dapat mencerminkan kondisi proliferasi sel itu sendiri. Aktivitas dehidrogenase laktat meningkat selama proliferasi sel, yang menyebabkan garam Tetrazolium atau Alamar Blue secara bertahap menurun di lingkungan sel yang aktif secara metabolik. Akibatnya, pewarna formazan yang dapat mengubah warna media pertumbuhan terbentuk. Kemudian kita dapat membaca absorbansi media yang mengandung pewarna tersebut dengan spektrofotometer dan dengan plate reader yang dapat mengukur aktivitas metabolisme sel dan mendeteksi proliferasi sel.

Empat garam tetrazolium yang paling umum adalah: MTT, XTT, MTS dan WST1. MTT tidak larut dalam media kultur sel standar, dan kristal formazan yang dibentuknya perlu dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO) atau isopropanol. Oleh karena itu, MTT terutama digunakan sebagai metode deteksi akhir. Tiga garam lainnya, seperti Alamar Blue, larut dan tidak beracun. Reagen garam ini dapat berfungsi sebagai alat pemantauan terus menerus untuk melihat perubahan dinamis dalam proliferasi sel. Di antara keempat garam tersebut, efisiensi XTT rendah, dan faktor tambahan perlu ditambahkan. WST1, di sisi lain, lebih sensitif dan efektif, menghasilkan pengembangan warna lebih cepat dibandingkan garam lainnya. Alamar Blue juga sangat sensitif, dapat mendeteksi meski hanya ada 100 sel saja di dalam well plate. Garam tetrazolium dan pewarna redoks Alamar Blue tersebut dapat digunakan pada berbagai instrumen.

Indogen sendiri menjual MTT powder 1 gram dari merk SangonBio di Yogyakarta, di Medan, di Surabaya, di Malang, di Medan, di Makassar dan di Bandung. Selain menjual MTT powder, Indogen juga menjual MTT Assay kit dari merk Bioassay Systems, Biovision, Cell Labs dan Elabscience.

MTT atau Thiazolyl blue tetrazolium bromide atau nama lainnya (3- (4,5-dimethyl-2-thiazolyl) -2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide) banyak digunakan untuk penentuan proliferasi sel dan sitotoksisitas. MTT berkurang dengan adanya suksinat dehidrogenase pada mitokondria sel hidup untuk membentuk kristal ungu gelap yaitu formazan. Formazan dapat dilarutkan dalam dimetil sulfoksida (DMSO). Absorbansi (nilai OD) diukur pada panjang gelombang 490 nm atau 570nm. Jumlah atau aktivitas sel hidup dapat ditentukan oleh nilai OD tersebut. Dalam rentang jumlah sel tertentu, jumlah pembentukan kristal MTT sebanding dengan jumlah atau aktivitas sel hidup.

Harga MTT powder yang dijual lebih murah dibandingkan dengan harga MTT kit. Hal ini menjadi pilihan untuk para peneliti atau mahasiswa yang ingin membeli MTT powder murah di Yogyakarta, di Medan, di Surabaya, di Malang, di Medan, di Makassar dan di Bandung. Namun, selain beli reagen MTT powder, harus ada beli reagen tambahan lainnya lagi. Sehingga bagi beberapa peneliti, hal ini menjadi pertimbangan untuk langsung membeli kit MTT. Dengan membeli kit MTT, peneliti tinggal melakukan pengujian proliferasi sel, tanpa harus membeli component kit lagi. Kitnya pun sudah lengkap, tidak perlu membeli component kit lain. Kit disertai dengan protocol kerja yang jelas dan hasilnya lebih sensitive karena sudah melalui quality control yang ketat.

2.  Marker Proliferasi Sel

Beberapa antigen hanya ada dalam sel yang sedang mengalami proliferasi, sedangkan sel yang tidak berproliferasi memiliki sedikit antigen ini. Anda juga dapat mendeteksi proliferasi sel dengan antibodi monoklonal spesifik. Sebagai contoh, dalam sel manusia, antibodi Ki-67 mengenali protein dengan nama yang sama dan diekspresikan dalam fase S-, G2-, dan M-dari siklus sel, tetapi tidak dalam fase G0- dan G1 (non- fase proliferatif). Proliferasi sel dapat dideteksi menggunakan antibodi terhadap protein Ki-67. Karena perlunya pengirisan jaringan, metode ini tidak memungkinkan untuk analisis berkinerja tinggi. Namun demikian, metode ini sangat populer di kalangan peneliti kanker karena dapat digunakan untuk mendeteksi proliferasi sel tumor in vivo dan in vitro. Marker proliferasi atau pengatur siklus sel yang umum digunakan termasuk diantaranya PCNA (proliferating cell nuclear antigen), topoisomerase IIB, dan histone terfosforilasi H3.

3.  Konsentrasi ATP

Kandungan ATP dalam sel dikontrol secara ketat, yang berarti dengan dideteksinya ATP, maka dapat memberikan informasi tentang proliferasi sel. Sel-sel mati atau sel-sel yang sekarat tidak mengandung ATP, dan ada hubungan linier yang kuat antara konsentrasi ATP terukur dalam lisat atau ekstrak sel dengan jumlah sel. Deteksi ATP menggunakan bioluminesen luciferase dan substratnya, luciferin, memberikan  hasil yang sangat sensitive. Jika terdapat ATP, luciferase akan memancarkan cahaya, dan intensitas luminesens sebanding dengan konsentrasi ATP. Baik luminometer dan plate reader yang dapat membaca sinyal luminesens dapat digunakan sebagai metode deteksi dengan mudah. Uji konsentrasi ATP sangat cocok untuk tes proliferasi sel dan skrining berkinerja tinggi.

4.  Sintesis DNA

Uji sintesis DNA adalah cara paling akurat dan andal untuk mendeteksi adanya proliferasi sel di laboratorium. Secara tradisional,  3H-thymine radiolabeled diinkubasi bersama sel selama beberapa jam atau semalaman. Sel-sel DNA yang baru berkembang biak akan menggabungkan radiolabel tersebut dan dapat dideteksi oleh scintillation counter setelah elusi. Keuntungan dari metode ini adalah thymidine (3H-TdR) akurat dan dapat diandalkan, sangat sensitif dan mudah dilakukan. Namun, alat scintillation counter mahal dan relatif memakan waktu. Kelemahan lainnya adalah mengenai kesulitan dan keamanan dalam menangani bahan radioaktif.

Sebagai alternatif pilihan, Anda dapat menggunakan bromodeoxyuridine non-radioaktif (BrdU) untuk melabel sel-sel DNA, dan kemudian menganalisis sel-sel tersebut menggunakan kolorimetri, chemiluminescence atau deteksi fluoresens. Jika Anda mempelajari sel tunggal, Anda dapat memasukkan BrdU ke dalam sintesis DNA sel-sel yang berproliferasi. Seperti 3H-TdR, BrdU dapat dimasukkan ke dalam sel fase-S DNA yang baru disintesis dengan bersaing dengan molekul timin endogen. Proliferasi sel sel berlabel BrDU dapat diukur menggunakan antibodi monoklonal anti-BrdU dan pewarnaan ICC/Immunocyto chemistry setelah menggabungkan BrdU menggunakan injeksi in vivo atau kultur sel.

BrdU cocok dalam berbagai aplikasi, seperti IHC, ICC, ELISA intraseluler, flow cytometry dan skrining berkinerja tinggi karena kurangnya molekul BrdU endogen