Metode deteksi kromogenik pada IHC menggunakan enzim yang mengubah substrat larut menjadi tidak larut, produk kromogenik.

Baca juga artikel mengenai teknik Imunohistokimia di sini

Enzim ini biasanya terkonjugasi dengan antibodi sekunder, yang akan mengikat antibodi primer terhadap protein yang diteliti. Antibodi primer yang langsung terkonjugasi dengan enzim juga bisa digunakan. Enzim yang paling banyak digunakan adalah  horseradish peroxidase (HRP), yang akan mengubah 3,3′-diaminobenzidine (DAB) menjadi produk berwarna coklat dan alkaline phosphatase (AP), yang akan mengubah 3-amino-9-ethylcarbazole (AEC) menjadi warna merah.

Berikut merupakan daftar produk DAB substrate yang disuplai oleh Indogen:

Empat metode utama deteksi kromogenik tidak langsung (indirect) telah banyak digunakan sekarang ini. Metode berbasis biotin menggunakan avidin-biotin complex (ABC) atau kompleks labeled streptavidin-biotin binding (LSAB). Sedangkan metode berbasis non-biotin menggunakan kompleks polimer atau kompleks mikro polimer.Karena tingginya amplifikasi sinyal yang terlibat pada metode ini, deteksi kromogenik juga biasanya lebih sensitif dibanding deteksi fluoresens. Tambahan pula, tidak seperti fluoropor, endapan warna yang terbentuk dari substrat misalnya DAB tahan terhadap cahaya, memungkinkan penyimpanan untuk beberapa tahun.  Tidak seperti deteksi fluoresens yang membutuhkan sumber cahaya dan filter, deteksi kromogenik hanya membutuhkan mikroskop biasa. Namun, prosedur penelitian lebih lama karena ada tahap inkubasi dan blocking dibandingkan dengan metode fluoresens.

Metode Avidin-biotin complex (ABC)

Aplikasi metode ABC bergantung pada antibodi sekunder yang dibiotinilasi dan kompleks enzim reporter avidin-biotin. Karena avidin bersifat tetravalent, terbentuklah kompleks yang cukup besar, menghasilkan intensitas sinyal yang tinggi.

Gambar 1. Prinsip kerja Metode Avidin-biotin complex

Deteksi berbasis ABC adalah salah satu metode pewarnaan yang paling banyak digunakan. Sistem ini memanfaatkan afinitas tinggi yang ditunjukkan antara protein avidin dan vitamin biotin. Avidin bersifat tetravalent, sehingga setiap molekul avidin dapat berikatan hingga empat konjugat biotinilasi. Dalam sistem ABC, avidin dan enzim yang dibiotinilasi digabungkan untuk membentuk kompleks makromolekul besar yang mengandung beberapa molekul enzim. Kompleks tambahan ini mengikat target yang dibiotinilasi, seperti antibodi primer atau antibodi sekunder, asam nukleat, lektin dan makromolekul. Ketika substrat enzim kromogenik ditambahkan akan menghasilkan endapan berwarna pada reaksi. Kompleks multi-enzim yang besar memperkuat sinyal, memberikan sensitivitas yang lebih besar.

VECTASTAIN® ABC detection system dari merk VectorLabs diformulasikan secara unik dengan Avidin DH dan konjugat enzim yang dibiotinilasi untuk memberikan sensitivitas sinyal yang ditingkatkan dengan background yang rendah. Kit ABC ini kompatibel dengan berbagai jenis target, aplikasi dan substrat. Sistem VECTASTAIN® ABC yang andal dan ekonomis ini telah menjadi  andalan di laboratorium imunohistokimia.

Gambar 2.  Dijual VECTASTAIN® Elite ABC-HRP Kit (Peroxidase, Universal) dan DAB Substrate Kit dari VectorLab

Berikut merupakan daftar produk VECTASTAIN® ABC Kit dari Vector Lab yang dijual oleh Indogen di Jakarta.

Metode Labeled streptavidin-biotin (LSAB)

Umumnya kit deteksi sekarang didasarkan pada varian LSAB dari metode ABC, yang menggunakan streptavidin,alih-alih avidin. Hasilnya berupa ikatan jaringan yang kurang non-spesifik, karena streptavidin tidak  terglikosilasi dan memiliki lebih banyak titik isoelektrik netral dibanding avidin.

Berikut merupakan daftar produk ABC detection kit dari ABCAM.

Metode Berbasis Polimer

Tantangan utama pada sistem berbasis biotin adalah adanya biotin endogen yang akan mempengaruhi background pewarnaan secara signifikan pada jaringan tertentu misalnya saja jaringan otak. Meski fiksasi formalin dan embedding paraffin mengurangi level biotin, antigen retrieval bisa menghasilkan tereksposnya biotin. Pada frozen section (potong beku), biotin endogen merupakan masalah yang penting. Meski langkah ekstra telah dilakukan misalnya dengan larutan blocking biotin yang bisa mengurangi background, metode berbasis polimer non biotin bisa menjadi alternatif.

Metode polimer generasi awal menggunakan tulang punggung dextran sebagai tempat perlekatan beberapa molekul enzim dan antibodi sekunder. Saat ini telah dikembangkan metode mikro-polimer  atau polimer kompak yang lebih unggul menggunakan kompleks deteksi yang lebih kecil dengan kecenderungan agregat yang lebih sedikit. Ini menghasilkan sensitivitas yang lebih besar melalui penetrasi jaringan yang lebih baik dan pengurangan pewarnaan background dari biotin endogen.

Gambar 3. Prinsip Kerja Metode Berbasis Polimer

Reagen berbasis polimer adalah metode deteksi yang bisa dikatakan baru dalam metode deteksi IHC dibandingkan dengan metode tradisional sebelumnya yaitu konjugat avidin dan biotin, misalnya saja format kit ABC. Polimer menawarkan keuntungan yang berbeda dibandingkan dengan metode tradisional terutama untuk aplikasi misalnya saja pelabelan banyak antigen (multiple antigen labeling atau multiplexing) pada jaringan yang sama atau dalam kasus dimana tingkat biotin endogen yang dapat dideteksi bisa menyebabkan masalah.

Sistem berbasis polimer pada dasarnya terdiri dari polimer terintegrasi dari enzim aktif dan antibodi sekunder yang mengikat target antibodi primer. Format terintegrasi ini memperkenalkan lebih banyak enzim pada situs lokalisasi, sehingga menyebabkan reaksi lebih besar dengan kromogen, dibandingkan dengan antibodi sekunder yang langsung terkonjugasi dengan enzim. Selain itu, penggunaan metode polimer one-step akan memperpendek prosedur IHC dengan menghindari two-step antibodi sekunder biotinilasi dan reagen ABC yang dibutuhkan untuk sistem avidin-biotin.

ImmPRESS® polymer systems have been highly refined and consist of micropolymers that penetrate more easily into thicker sections, avoid steric hindrance concerns, and provide defined, specific binding to the primary antibody.

Berikut merupakan daftar produk Kit Deteksi IHC Micropolymer dari merk ABCAM.

Metode Multiwarna

If multiple antigens are of interest then it is possible to stain up to three different antigens at the same time using different colored chromogens. This typically requires primary antibodies that are raised in different species, unless the antigen is present at a high enough level that a primary antibody directly conjugated to the reporter enzyme can be used.

Blocking agents can also be used that enable staining with one primary antibody raised in a particular species, followed by blocking of secondary antibody binding sites on that primary antibody, and then staining with a second primary antibody raised in the same species.

https://docs.abcam.com/pdf/kits/immunohistochemistry-ihc-application-guide.pdf

Multiple markers can be immunostained in a single tissue section using multi-color IHC (mIHC). Traditional chromogenic mIHC relies on each antibody being raised in a different species or of a different isotype. Specific secondary antibodies are then used, with a different chromogen for each marker. However, it is hard to distinguish more than two chromogens on a slide, particularly if any chromogens overlay each other.

Fluorescent mIHC can be easily used with three or more markers. It can be used with fluorescent dye conjugated primary antibodies however it is more commonly used with dye conjugated secondary antibodies, due to their extra amplification, and the limited availability of primary dye conjugates. Most fluorescent mIHC is limited to three markers (plus a counterstain) by available fluorescence filter sets, and by the need for each primary antibody to be raised in a different species / have a different isotype.

The most common methods to increase the number of markers further use: a) spectral unmixing microscopes that enable more fluorescent dyes to be distinguished; and b) sequential antibody stripping and staining methods, often with tyramide signal amplification. Other methods such as imaging mass cytometry, rely on generating a pseudo-image. mIHC permits high-content data to be generated from one tissue section, effectively reducing the amount of tissue required, and allowing the relationship between different markers to be better understood.