Sekilas Tentang ELISA

Teknik ELISA pertama kali dilaporkan oleh 2 ilmuwan Swedia Peter Perlmann (peneliti utama) dan Eva Engvall. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) menggunakan antibodi untuk mendeteksi protein dan imunogen lain yang berbeda. Sejak penemuannya, ELISA sekarang memiliki banyak aplikasi analitis dan klinis. 

Seiring dengan berjalannya waktu, ELISA memiliki berbagai versi sistem deteksi diantaranya colorimetric, fluorescent, dan luminescent. Semua jenis sistem deteksi ELISA membutuhkan antigen atau antibodi yang bergerak ke permukaan. Juga membutuhkan enzim dan substrat yang cocok untuk sistem deteksi. Berikut akan dibahas mengenai sistem deteksi pada ELISA.

 

Metode Deteksi

B1. Colorimetric assay

Pada pengujian colorimetric dihasilkan produk berwarna yang menyerap cahaya pada kisaran cahaya tampak (visible). Panjang gelombang yang dapat mendeteksi pengujian colorimetric yaitu 380 – 700 nm.

 

Menentukan label enzim 

Enzim yang paling umum digunakan diantaranya horseradish peroxidase, calf intestine alkaline phosphatase, dan E. coli ß-D-galactosidase. Namun yang paling sering digunakan dalam teknik ini adalah peroxidase dan alkaline phosphatase, keduanya cukup stabil dan dapat bertahan selama 6 bulan pada suhu penyimpanan 4℃. Ada beberapa pertimbangan dalam pemilihan enzim-enzim ini:

 

• Peroxidase

Enzim Peroxidase memiliki berat molekul yang kecil sekitar 4000, biasanya dikonjugasi ke antibodi dengan perbandingan 4:1. Karena enzim ini memiliki ukuran yang kecil sehingga jarang mengalami masalah sterik dengan kompleks antibodi atau antigen yang terikat pada permukaan atau dasar plate. Dari segi harga, enzim peroxidase lebih kompetitif dibandingkan dengan alkali fosfatase. Saat ini tersedia enzim peroxidase yang dijual dipasaran. Berikut list produk enzim peroxidase yang dapat anda beli di perusahaan Indogen Intertama.

 

Tabel 1. Enzim Peroxidase

Brand	No. Catalog	Deskripsi	Qyt
Solarbio	P8021	Peroxidase(POD)	10mg
Elabscience	E-ELIR-007	HRP-conjugate Stabilizer	10 ml 100 ml 500 ml
Elabscience	E-ELIR-008	HRP-conjugate Diluent	100 ml 100 ml

 

Beberapa substrat dengan reaksi enzim akan menghasilkan produk yang larut dalam air atau tidak larut air. Karena semua reaksi peroxidase membutuhkan hidrogen peroksida, disarankan memilih substrat yang sudah mengandung hidrogen peroksida sehingga menambah nilai dan kegunaan.

Kekurangan dari enzim peroxidase ini tidak tahan terhadap bahan pengawet misalnya sodium azide. Biasanya sodium azide ini digunakan untuk mengurangi kontaminasi mikroba dalam larutan penyangga atau buffer. Sebagai gantinya gunakan larutan penyangga steril tanpa bahan pengawet, dengan air tpe II. Dan untuk spesimen atau sampel dipastikan dicuci dahulu sebelum ditambahkan enzim agar aktivitas endogen peroxidase tidak terganggu.

 

• Alkaline Fosfatase

Alkaline fosfatase memiliki berat molekul dua kali lipat dari enzim peroxidase, sekitar 86.000. Hal ini akan terlihat rasio konjugasi enzim terhadap antibodi lebih rendah dan karena ukuran molekulnya yang besar dapat menimbulkan sterik. Alkali fosfatase lebih mahal dibandingkan dengan peroxidase, namun lebih stabil.

Substrat untuk alkali fosfat berkisar dari yang larut sampai tidak larut. Kekurangan alkali fosfatase adalah enzim tersebut tidak aktif oleh agen chelating (EDTA), asam (pH < 4.5), atau fosfat anorganik. Sehingga penggunaan buffer untuk enzim ini harus spesifik dan tidak boleh bersentuhan dengan fosfat buffer selama pengujian. Namun untuk chelator dan bahan asam dapat digunakan sebagai penghenti reaksi dalam proses ELISA.

 

• ß-galactosidase

Enzim ß-galactosidase paling sedikit peminatnya. Berat molekul enzim ini sangat tinggi yaitu > 300.000, sehingga tidak populer. Keuntungan dari enzim ß-galactosidase laju reaksinya meningkat dengan adanya alkohol, cocok untuk pengujian yang dilakukan pada permukaan membran hidrofobik (yaitu, aplikasi dot blot) yang memerlukan alkohol untuk dibasahi. 

Enzim yang cocok untuk uji colorimetric, dari ketiga enzim ini yaitu enzim peroxidase dan alkali fosfatase. Reaksi kedua enzim tersebut dengan substratnya dapat memberikan hasil kuantitatif dan kualitatif.

 

Menentukan Substrat Uji Colorimetric

Untuk semua jenis enzyme-linked immunoassay tahap akhir paling penting yaitu penambahan substrat. Substrat yang dipilih untuk data kuantitatif berdasarkan hasil produk terwarna, fluorescent, atau luminescent. Pada pengujian colorimetric, dapat terhitung dengan pembentukan warna yang proporsional, dalam rentang waktu tertentu sampai dengan angka konjugat enzim yang hadir.

Substrat dalam reaksinya dengan enzim dapat membentuk produk berwarna terlarut dan tidak terlarut. Substrat yang mampu menghasilkan produk terlarut itulah yang lebih cocok untuk ELISA. Biasanya produk hasil reaksi yang tidak larut digunakan untuk pengujian berbasis membran, seperti dot blot. Dot  Blot  adalah  sebuah  teknik  untuk  mendeteksi,  menganalisis,  dan mengidentifikasi  protein. Teknik  ini  menyerupai  Western  Blot  namun perbedaannya  adalah protein  sampel  tidak dipisahkan  melalui  elektroforesis akan  tetapi  ditandai dengan  template sirkuler  secara langsung  pada substrat kertas.  

Enzim peroxidase dan fosfatase memiliki substrat yang mampu menghasilkan produk berwarna terlarut. Beberapa hal penting yang perlu diperhatikan dalam memilih substrat diantaranya sensitivitas, waktu, dan perangkat deteksi yang digunakan.  

Untuk pengujian yang sangat sensitif atau jumlah analitnya rendah, dibutuhkan substrat yang mampu menghasilkan reaksi sangat berwarna dengan laju reaksi yang sangat cepat.

Untuk pengujian yang memerlukan rentang yang luas (konsentrasi analit luas), dibutuhkan substrat yang memiliki laju reaksi yang lama (15 – 30 menit) dan menghasilkan intensitas warna yang luar. 

Untuk pengujian dengan rentang waktu tertentu, dapat menambahkan inhibitor kimia pada saat reaksi berlangsung guna menghentikan reaksi pewarnaan yang terjadi. Hal ini memungkinkan deteksi dilakukan dengan waktu yang wajar yaitu menggunakan substrat dengan laju reaksi lambat (15-30 menit). Namun jika dilakukannya analisis kinetik pada enzim-substrat, diperlukan substrat dengan laju reaksi cepat (≦ 5 menit). Pada kasus ini substrat ditambahkan dan laju konversi substrat menjadi berwarna segera diukur. Reaksi biasanya diukur dengan hati-hati dan dalam interval waktu misalnya 10 detik selama 2-5 menit.

Berikut ini beberapa substrat yang paling umum digunakan untuk enzim peroxidase dan fosfatase:

1. Substrat untuk enzim Peroxidase
   Tiga substrat yang paling umum yang menghasilkan produk tidak larut yaitu, TMB (3,3′,5,5′ tetramethylbenzidine), DAB (3,3′,4,4′ diaminobenzidine), dan 4CN (4-chloro-1-naphthol). Sedangkan substrat yang mampu menghasilkan produk terlarut diantaranya TMB (dual function substrate), ABTS (2,2′-azino-di[3-ethylbenzothiazoline ]sulfonate), dan OPD o-phenylenediamine).

   • TMB 

   TMB merupakan substrat yang sangat sensitif. TMB memiliki laju reaksi yang cepat sehingga cocok untuk analisis kinetik, yang menghasilkan warna biru, diukur pada panjang gelombang 650 nm. 

   TMB juga dapat digunakan dalam pengujian waktu tertentu, dengan menambahkan asam fosfat 1M untuk menghentikan reaksinya. Hasil pengujian ini akan menghasilkan warna kuning dan diukur pada panjang gelombang 450 nm. 

   • ABTS

   ABTS dikenal sebagai substrat yang serbaguna. Meski dinilai kurang sensitif dibanding dengan TMB dan OPD, namun ABTS memiliki spektrum yang luas dan tersedia untuk enzim peroxidase maupun alkali fosfat. 

   Produk yang dihasilkan dari substrat ABTS berwarna hijau-biru, dapat diukur dengan panjang gelombang 405 – 410 nm. Laju reaksinya cocok untuk pengujian waktu tertentu dan mudah terhenti dengan 1% SDS (sodium dodecyl sulfate), yang tidak merubah warna atau absorbansi reaksi.

   • OPD

   Substrat OPD pernah menjadi substrat yang populer namun kini digantikan oleh TMB, karena sensitivitasnya lebih rendah dibandingkan TMB. Produk hasil reaksinya berwarna kuning, dan dapat diukur pada panjang gelombang 490 nm. 

   Berikut adalah list produk substrat enzim Peroxidase yang dapat ditemukan di PT. INDOGEN INTERTAMA.

 

Tabel 2. Substrat enzim Peroxidase dalam Pengujian Colorimetric

Brand	No. Catalog	Deskripsi	Qty
Elabscience	E-IR-R201	One-component TMB Substrate	30 mL 100 mL 500 mL 1000 mL
Abcam	ab210902	TMB substrate 1X	120 ml
Abcam	ab142042	TMB, Peroxidase substrate (Ultrasensitive)	100 ml
SolarBio	T8140	TMB dihydrochloride	250 mg
Abcam	ab142041	ABTS™, Peroxidase substrate	100 ml
Abcam	ab146343	ABTS diammonium salt, chromogenic peroxidase substrat	1 g 5 g

Substrat paling umum penghasil produk tidak larut dalam reaksinya dengan enzim alkali fosfatase yaitu BCIP/NBT (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/ nitroblue tetrazolium). BCIP sangat cocok untuk pengujian immunoblot karena stabil dan tahan terhadap kehilangan warna saat terkena cahaya.

 

Substrat untuk enzim Alkali Fosfatase

Sedangkan untuk substrat yang menghasilkan produk larut yaitu p-NPP (p nitrophenyl phosphate). p-NPP menghasilkan warna kuning kuat, yang dapat diukur pada panjang gelombang 405 – 410 nm. 

p-NPP ini merupakan substrat dengan laju reaksi lambat dan harus dibiarkan 30 – 60 menit untuk mencapai warna yang optimal sebelum dihentikan dengan 1N NaOH. Substrat sebaiknya tidak digunakan untuk analisis kinetis.

Di bawah ini substrat untuk enzim alkali fosfatase yang ada di PT. INDOGEN INTERTAMA.

 

Tabel 3. Substrat enzim Fosfatase

Brand	No. Catalog	Deskripsi	Qty
Abcam	ab7468	NBT / BCIP Solution - Ready to Use Alkaline Phosphatase chromogen	100 ml
Abcam	ab7413	Alkaline Phosphatase chromogen (BCIP/TNBT)	100 ml
Abcam	ab146203	pNPP-Na hexahydrate, Alkaline phosphatase substrate	5 g 25 g
SolarBio	N8150	p-NPP	1 g

B2. Fluorescent assay

Pengujian Fluorescent immunoassay (ELFIA) merupakan bentuk sederhana dari jenis ELISA colorimetric. Prinsip kerja dari pengujian Fluorescent immunoassay yaitu enzim-substrat menghasilkan produk berfluoresensi ketika tereksitasi oleh cahaya dengan panjang gelombang tertentu.

Satuan fluoresens relatif (foton cahaya yang dipancarkan) biasanya sebanding dengan jumlah analit yang diukur. Fluorescent immunoassay lebih sedikit sensitif jika dibandingkan dengan ELISA Colorimetric. 

 

Menentukan label enzim

Sama seperti ELISA Colorimetric, pengujian Fluorescent juga pakai 3 enzim yang telah dijelaskan di atas. Namun tingkat enzim yang paling sering digunakan pertama yaitu enzim alkali fosfatase, disusul oleh ß-galactosidase dan terakhir enzim peroxidase. Substrat stabil untuk ketiga enzim tersebut sudah tersedia secara konvensional.

 

Menentukan Substrat Uji Fluorescent

Pengujian Fluorescent membutuhkan substrat fluorogenik untuk mengukur emisi cahaya yang tereksitasi. Substrat harus stabil pada suhu ruang dan pada cahaya normal ruangan. 

Ketiga enzim memiliki satu atau dua substrat fluorogenik yang cocok untuk aplikasi Fluorescent.

 

• Substrat untuk Enzim Alkali Fosfatase

Enzim Alkali fosfatase biasanya dipasangkan dengan substrat 4-MUP (4-methylumbelliferyl phosphate). Substrat 4-MUP akan dikonversi menjadi 4-methylumbelliferone dengan panjang gelombang eksitasi 360 nm dan 440 nm. Substrat 4-MUP ini harus dilarutkan terlebih dahulu dengan pelarut yang mengandung 100 mM diethanolamine, 1 mM MgCl2, pH 9.6. Sediaan 4-MUP dalam bentuk cair sudah tersedia di pasaran, namun hasil akan lebih baik jika menggunakan substrat yang disiapkan sendiri atau dalam keadaan fresh. 

Berikut daftar produk substrat enzim alkali fosfatase untuk uji Fluorescent.

 

Tabel 4. Substrat enzim Alkali Fosfatase dalam Pengujian Fluorescent

Brand	No. Catalog	Deskripsi	Qty
Abcam	ab146521	MUP disodium salt trihydrate, Fluorogenic phosphatase	1 g

 

• Substrat untuk Enzim ß-galactosidase

Substrat untuk enzim ß-galactosidase sama dengan substrat alkali fosfatase yaitu 4-MUP. Penggunaan substrat 4-MUP ini dapat meningkatkan deteksi ekspresi gen pelapor, bentuk substrat 4-MUP ready-to-use tersedia untuk aplikasi non-ELISA. 

 

• Substrat untuk Enzim Peroxidase

Terdapat dua substrat untuk label enzim Peroxidase diantaranya HPA (hydroxyphenylacetic acid) dan HPPA (3-p-hydroxyphenyl propionic acid). Kedua substrat ini membutuhkan hidrogen peroksida untuk menghasilkan produk fluoresen. HPPA paling banyak digunakan untuk aplikasi fluorescent. Pengukuran substrat tersebut yaitu pada panjang gelombang eksitasi 320 nm dan 404 nm. Saat ini telah tersedia dipasaran untuk substrat fluorescent yang stabil pada enzim peroxidase. 

 

B3. Luminescent assay

Pengujian luminescent mirip dengan fluorescent. Prinsip kerja luminescent yaitu enzim akan mengubah substrat menjadi produk dengan adanya reaksi pemancaran foton cahaya yang akan membentuk warna yang terukur dengan satuan relative light units (RLU). Terdapat beberapa bentuk luminescent, diantaranya:

• Bioluminescence: cirinya menggunakan komponen bioluminescent, seperti luciferin dan firefly luciferase.
• Chemiluminescence: cahaya dihasilkan dari reaksi kimia
• Photoluminescence: merupakan fluorescent sederhana, eksitasi dimulai oleh cahaya pada panjang gelombang tertentu.   

Dari ketiga macam luminescent di atas yang umum digunakan dalam pengujian immunoassay yaitu Bioluminescence dan Chemiluminescence. Dipercaya pengujian dengan luminescent saat ini dinilai yang paling sensitif karena kemampuannya meningkatkan sinyal. 

 

Menentukan Label Enzim untuk Luminescent

Dari ketiga enzim yang sering digunakan dalam uji immunoassay, enzim peroxidase paling banyak digunakan dalam luminescent. Enzim Peroksidase dapat digunakan dengan sistem bioluminescent atau chemiluminescent dan mudah ditingkatkan untuk memungkinkan mendeteksi cahaya secara secara intens dalam jangka waktu yang lama, hal ini yang membuatnya kompatibel dengan semua format ukuran microplate. 

 

Menentukan Substrat untuk uji Luminescent

Yang perlu diperhatikan dalam memilih substrat dalam aplikasi Luminescent diantaranya karena:

• Pendaran cahaya pada area dasar background rendah sehingga perlu memilih substrat yang cocok.
• Diperlukan substrat yang dapat menghasilkan cahaya kuat pada sisi aktifnya.
• Reaksinya harus menghasilkan emisi cahaya dalam jangka waktu yang lama (hitungan menit). 
• Tersedia substrat komersial yang berkualitas dan konsisten.

Tiga enzim yang paling banyak digunakan memiliki substrat satu sampai beberapa substrat yang sesuai.

 

Substrat untuk Enzim Peroxidase

Peroxidase memiliki substrat yang paling luas, diantaranya, ada luminol, polyphenols & acridine esters, dan luciferin. Substrat yang termasuk polyphenol diantaranya pyrogallol, purpurogallin, gallic acid, dan umbelliferone. Substrat polifenol dan ester akridin hanya dapat digunakan bersama dengan detektor luminescent yang dilengkapi untuk menangani reaksi “flash”. Dan substrat yang paling sering digunakan untuk pengujian ini yaitu luminol, dan sudah tersedia juga luminol dalam bentuk stabil yang ada dipasaran.

Berikut daftar produk substrat enzim Peroxidase untuk pengujian Luminescent.

 

Tabel 5. Substrat enzim Peroxidase dalam Pengujian Luminescent

Brand	No. Catalog	Deskripsi	Qyt
Elabscience	E-IR-R301	Excellent Chemiluminescent Substrate (ECL) Kit	50 ml
Elabscience	E-BC-R347	Excellent Chemiluminescent Substrate Detection Kit	Kit
SolarBio	L8180	Luminol	1 g
SolarBio	P7540	Pyrogallol	100 g
SolarBio	G8720	Gallic acid	50 g
SolarBio	M8310	4-Methylumbelliferone	10 g
SolarBio	A8120	Acridine Orange	1 g
SolarBio	D9390	D-Luciferin, sodium salt	100 mg

 

Substrat untuk Enzim ß-galactosidase dan Alkali Fosfatase 

Enzim ß-galaktosidase dan Alkali Fosfatase memiliki hanya memiliki satu substrat. Substrat alkali fosfatase yaitu AMPPD (3-(2′-spiro adamantane) -4-methyl-4-(3 ‘phosphoryloxy phenyl-1, 2-dioxetane, disodium salt). Sedangkan enzim ß-galaktosidase yaitu AMPGD (3-(2′-spiro adamantane)-4 methoxy-4-(3’-ßD-galactopyranosyl oxyphenyl 1,2-dioxetane). Kedua substrat ini kompatibel dengan enhancer yang tersedia di pasaran. Adapun substrat yang tersedia dalam bentuk kit lengkap dengan buffer dan komponen lainnya untuk kerja yang optimal. 

 

Sumber

1. https://www.corning.com/catalog/cls/documents/application-notes/CLS-DD-AN-458.pdf
2. https://www.sigmaaldrich.com/life-science/biochemicals/biochemical-products.html?TablePage=14539571
3. https://www.thermofisher.com/id/en/home/life-science/antibodies/immunoassays/elisa-kits/elisa-enzyme-substrates.html 
4. https://www.thermofisher.com/id/en/home/references/molecular-probes-the-handbook/enzyme-substrates.html