Sebelumnya kami telah ulas sebagian tentang Exosome pada artikel Exosome: Klasifikasi, Teknik Isolasi dan Aplikasi Diagnostik (Bagian 1). Rangkuman dari artikel sebelumnya yang telah diulas yaitu terkait pengertian umum exosome, fungsi exosome sebagai biomarker diagnostik dan keragamanannya. Pada bagian 2 ini kami akan mengulas lebih mengenai teknik isolasi Exosome menggunakan seperangkat kit atau reagen deteksi dari suatu perusahaan USA yaitu SYSTEM BIOSCIENCES (SBI).

Teknik isolasi Exosome dapat berbeda dilihat dari sumber sampel (kultur jaringan, cairan asites penyakit berbahaya, urine, plasma dan cairan tubuh lainnya), jumlah sampel dan berhubungan juga dengan tujuan dari isolasi exosome tersebut. Berikut ini berbagai macam teknik isolasi exosome yang dapat membantu dalam penelitian anda.

A. Ultrasentrifugasi

Beberapa tahun terakhir teknik ultrasentrifugasi menjadi pilihan untuk memekatkan dan mengisolasi exosome. Kedua teknik yang umum digunakan yaitu ultrasentrifugasi diferensial dan gradien densitas, keduanya dapat dilanjutkan dengan metode filtrasi ukuran. Namun metode filtrasi ukuran dengan diawali ultrasentrifugasi diferensial tidak dapat sepenuhnya memisahkan eksosom berdasarkan ukuran partikel dikarenakan kepadatan muatan mengubah perilaku exosome tersebut saat disentrifugasi dengan teknik ultrasentrifugasi diferensial. Selain itu, kompleks protein ekstravasikuler dan agregat, lipoprotein, serta kontaminan lainnya dapat terendapkan bercampur exosome dengan putaran berkecepatan tinggi. Sedangkan pada metode sentrifugasi densitas dapat memisahkan kontaminan ekstravesikuler ini, tetapi mungkin masih tidak dapat memisahkan eksosom dari vesikel ekstraseluler lain dengan kepadatan yang sama. Untuk mempersingkat prosedur pada teknik atau metode ultrasentrifugasi gradien densitas, ExoMAX Opti Enhancer adalah reagen yang mudah digunakan yang dapat memindahkan sampel ke gradien kepadatan dalam tiga langkah mudah.

Walaupun sering digunakan, ultrasentrifugasi memiliki beberapa kelemahan, terutama untuk studi biomarker atau diagnostik menggunakan sampel klinis. Ultrasentrifugasi memakan waktu – beberapa putaran dapat memakan waktu semalam, membutuhkan volume sampel yang cukup banyak, sehingga menghambat penggunaan sampel klinis volume rendah atau sistem model hewan, tidak cocok untuk memproses sampel dalam jumlah besar, dan memerlukan akses untuk mendapatkan sampel. Penelitian terakhir menunjukkan eksosom yang diisolasi dengan ultrasentrifugasi mungkin memiliki lebih banyak kontaminan puing seluler daripada metode isolasi lainnya, banyak vesikel pecah selama proses ultrasentrifugasi kecepatan tinggi, dikenal dengan “splat factor”.

B. Size Exclusion

Filtrasi dan kromatografi dapat digunakan untuk mengisolasi eksosom, meskipun metode ini biasanya digunakan bersamaan dengan ultrasentrifugasi. Pertanyaan tentang exosome deformasi atau disintegrasi – sekali lagi, splat factor – membatasi metode filtrasi untuk metode berbasis gravitasi, selain kekhawatiran tentang kontaminan yang dapat dilepaskan ke dalam larutan dengan eksosom, dan pelepasan eksosom dari filter atau media.

C. Immunoprecipitation (IP)

Karena exosome memunculkan protein permukaan spesifik, imunopresipitasi (IP) dapat digunakan untuk memurnikan eksosom. Metode berbasis IP dapat dilakukan dengan menggunakan magnetic beads (Exo-Flow beads). Namun membutuhkan pengetahuan yang sudah ada sebelumnya tentang eksosom yang telah diteliti dan keterkaitan dengan antibodi. Sebagai tambahan, metode ini mungkin membiaskan populasi exosome yang diisolasi.

D. Polymeric Precipitation

Polymeric Precipitation merupakan metode yang cepat untuk mengisolasi exosome tanpa melakukan ultrasentrifugasi, dapat digunakan dengan volume sampel yang lebih kecil, dan dapat digunakan untuk memproses sampel dalam jumlah besar dengan cepat, sehingga cocok untuk digunakan dengan sampel klinis. Dengan ExoQuick ULTRA, peneliti dapat mengisolasi exosome hanya dari 100 µl sampel, pemulihan bersifat kuantitatif dan linier saat volume meningkat, dan kualitas serta kemurnian eksosom cocok untuk sejumlah besar aplikasi.

E. Tambahan untuk isolasi exosome menggunakan kultur sel

Fetal Bovine Serum (FBS) adalah salah satu suplemen serum yang paling banyak digunakan untuk kultur sel eukariotik. Namun, para peneliti exosome perlu menyadari bahwa FBS akan mengandung exosome sapi. Oleh karena itu, sangat penting untuk menggunakan FBS yang tidak mengandung exosome bawaanya, untuk itu SBI mengeluarkan produk untuk menghilangkan exosome yang terkandung pada FBS yaitu Exosome-depleted FBS.

F. Kesimpulan

Para peneliti memiliki banyak pilihan untuk mengisolasi exosome. SBI telah memiliki berbagai produk untuk mempermudah dalam isolasi exosome, sehingga memungkinkan para peneliti akan lebih fokus pada upaya pemanfaatan exosome dan memiliki waktu lebih efektif untuk tim pengadaan dalam mencari produknya.

Sumber:

1. Exosome Isolation
2. Witwer, K. W. et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. J. Extracell. Vesicles 2, (2013).
3. Lobb, R. J. et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. J. Extracell. Vesicles 4 (2015).