Gel Elektroforesis

Elektroforesis gel poliakrilamid (PAGE) mampu memisahkan protein berdasarkan struktur dan titik isoelektriknya (native-PAGE dan SDS-PAGE). Protein harus memiliki muatan negatif untuk bermigrasi melalui pori-pori gel saat berada pada medan elektromagnetik. Pada Native-PAGE, selain muatan intrinsik negatif protein, Coomassie G-250 juga memberi protein muatan negatif pada protein. Pada SDS-PAGE, semua protein bermuatan negatif akibat pengikatan SDS

Gambar 1. Skema elektroforesis SDS-Page.

Gel poliakrilamid terdiri dari campuran poliakrilamid dan bis-akrilamid yang membentuk polimer berikatan silang oleh amonium persulfat (APS) dan katalis TEMED. Ukuran pori gel dioptimalkan dan disesuaikan dengan rasio dan konsentrasi poliakrilamid dan bis-poliakrilamid serta disesuaikan juga dengan ukuran protein target. Konsentrasi yang lebih tinggi memberikan pori-pori yang lebih kecil. Ada dua jenis gel utama yang umum digunakan di WB:

● gel dua-bagian, yang terdiri dari stacking gel dan resolving gel. Stacking gel memiliki persentase akrilamida lebih rendah, pH lebih rendah, dan komposisi ionik berbeda yang membantu memipihkan protein, dan
● gel gradien di mana konsentrasi akrilamida semakin meningkat.

Transfer listrik (Elektrotransfer)

Protein yang dipisahkan oleh PAGE perlu dipindahkan dari gel ke membran melalui transfer elektroforesis (elektrotransfer). Sandwich blot disiapkan di mana membran menyentuh gel dengan erat dan diapit di antara kertas saring dalam buffer transfer. Pastikan kontak baik antara gel dan membran karena gelembung udara dapat mencegah transfer. Medan elektromagnetik diterapkan tegak lurus ke permukaan gel untuk mentransfer protein dari gel ke membran. Efikasi transfer dapat bervariasi tergantung pada protein, protokol dan peralatan. Ada beberapa pilihan untuk melakukan elektrotransfer dengan pilihan: metode, membran, dan buffer.

Metode

Transfer basah

Kontak erat antara gel dan membran selama elektrotransfer dipastikan dengan support padat dan kondisi sandwich seluruhnya terendam dalam buffer transfer. Transfer basah lebih fleksibel untuk pengoptimalan (waktu, voltase) dan dengan pendinginan tepat dapat dilakukan semalaman sehingga menghasilkan transfer lebih baik. Metode ini memungkinkan transfer rentangan ukuran protein lebih luas dan cukup menguntungkan untuk protein berukuran besar (>100 kDa). Kelemahan utama metode yaitu membutuhkan waktu lebih lama (sekurangnya 1 jam) dan membutuhkan volume buffer yang lebih besar.

Transfer semi-kering

Sandwich ditempatkan langsung di antara elektroda. Hanya kertas saring yang direndam dengan buffer transfer. Metode ini lebih cepat (10 menit hingga satu jam) dan banyak membran dapat diproses pada waktu bersamaan dengan penggunaan buffer minimal. Namun metode semi-kering memiliki kapasitas buffer rendah dan tidak dapat dilakukan dalam waktu lama karena resiko kering. Sehingga transfer ini menjadi kurang efektif dan dapat menyebabkan kesulitan dalam mendeteksi target protein, terutama jika protein memiliki berat molekul tinggi dan/atau tidak banyak ditemukan. Namun karena kemudahannya, metode semi-kering sering disukai.

Gambar 2. Skema sandwich blot dalam transfer semi-kering

Membran

Nitroselulosa

Nitroselulosa diberi muatan dan mengikat protein secara cepat melalui bagian hidrofilik. Membran ini tidak sesuai dan lebih lemah untuk probing ulang saat pengupasan

Polyvinylidene fluoride (PVDF)

PVDF merupakan membran tidak bermuatan dan mengikat protein pada bagian hidrofobik. membran ini memiliki kemampuan pengikatan lebih baik tetapi cenderung memberikan background lebih tinggi daripada nitroselulosa. Karena sifatnya yang hidrofobik, sehingga perlu diaktivasi dengan metanol sebelum digunakan. Dengan kekuatan mekanik dan stabilitas kimia yang tinggi, PVDF merupakan pilihan yang lebih disukai untuk probing berulang.

Berikut merupakan membrane PVDF dari merk SolarBio dengan porositas 0.45 μm. Membrane PVDF ini lebih sering digunakan oleh para peneliti karena memiliki stabilitas lebih baik dibanding jenis membran lainnya.

Gambar 1. Membrane PVDF merk Elabscience

Komposisi buffer

Buffer transfer didasarkan pada larutan Tris dan glisin yang dilengkapi dengan metanol dan SDS. Keseimbangan antara SDS dan metanol bersifat penting karena dapat mempengaruhi efisiensi transfer serta harus disesuaikan dengan ukuran protein. SDS meningkatkan kelarutan dan migrasi protein tetapi mengurangi pengikatannya ke membran, sedangkan metanol mempresipitasi protein sehingga mengurangi migrasinya tetapi meningkatkan pengikatan protein ke membran.

Larutan penyangga atau buffer yang paling banyak digunakan adalah PBS. Elabscience menyuplai PBS dengan pH 7 yang ready to use.

Gambar 2. PBS pH 7 merk Elabscience

Blocking

Membran yang digunakan dalam elektrotransfer ditandai dengan kemampuan pengikatan protein yang tinggi, sehingga permukaan kosong memerlukan blocking untuk mengurangi background. Solusi blocking ideal perlu dioptimalkan namun secara umum dapat menggunakan 1–5% susu kering tanpa lemak (NFDM) atau larutan bovine serum albumin (BSA). NFDM banyak digunakan tetapi tidak direkomendasikan untuk deteksi protein terfosforilasi karena mengandung banyak kasein yang merupakan fosfoprotein dapat meningkatkan background.

Gambar 3. Skim Milk Powder merk Elabscience

Probing

Setelah blocking, membran perlu diperiksa dengan antibodi yang mengenali protein target. Langkah ini sangat penting dan memerlukan pengoptimalan ekstensif. Probing dapat dilakukan dalam satu atau dua langkah. Dalam pemeriksaan satu langkah probing, antibodi dikonjugasikan dengan enzim (HRP atau AP) atau fluorophore. Probing satu langkah cepat dan mungkin berguna untuk aplikasi deteksi jumlah yang banyak. Dalam pemeriksaan dua langkah probing, dua antibodi digunakan yaitu antibodi primer dan antibodi sekunder. Dua langkah ini berfungsi dalam penguatan sinyal yang meningkatkan sensitivitas pengujian. Dalam beberapa kasus, antibodi dapat digantikan oleh protein lain yang mengenali target, misalnya avidin atau streptavidin yang mirip dengan antibodi dapat dikonjugasikan serta kemudian mengikat biotin. Dengan demikian semua protein terbiotinilasi dapat dideteksi.

Gambar 4. Prestained Protein Marker

Pencucian

Antibodi yang tidak terikat akan menyebabkan peningkatan background dan harus dihilangkan tanpa mempengaruhi pengikatan target. Larutan detergen yang sangat lembut dapat digunakan untuk pencucian.

Deteksi

Metode umum deteksi yaitu menggunakan antibodi terkonjugasi dengan enzim HRP dan AP. Reaksi kimia yang dikatalisis oleh enzim melepaskan cahaya (chemiluminescence) yang dapat dideteksi menggunakan film sinar-X atau peralatan pencitraan (Gel Doc) ataupun memberikan kenampakan produk akhir yang mengendap pada membran (chromogenic/deteksi kolorimetri). Pemantauan secara real-time juga dapat dilakukan dan tidak memerlukan peralatan tambahan meskipun kurang sensitif dibandingkan dengan chemiluminescence serta tidak sesuai untuk probing berulang.

Antibodi juga dapat dikonjugasikan dengan fluorofor seperti fluorescein (FITC) atau rhodamine (TRITC) yang memungkinkan visualisasi langsung dari antibodi menggunakan fluoresensi. Metode deteksi ini biasanya 2-4 kali kurang sensitif dibandingkan dengan chemiluminescence tetapi memberikan rentang dinamis linier lebih baik (hingga 10 kali lipat) sehingga memungkinkan kuantifikasi lebih baik. Fluoresensi juga cocok untuk mendeteksi beberapa target bersamaan dengan penggunaan fluorofor berbeda. Pengembangan fluorofor inframerah dan near-inframerah telah meningkatkan rasio signal-to-noise serta meningkatkan sensitivitas teknik ini.

Pengupasan (Stripping)

Pengupasan bersifat opsional dalam WB dan mungkin bermanfaat dalam probing berulang untuk target protein berbeda dengan antibodi berbeda juga. Semua antibodi pada membran perlu dihilangkan dengan beberapa metode pengupasan dikembangkan, yakninya pengupasan ringan (dengan buffer pH = 2,2 dan 0,1% SDS) atau pengupasan kasar (inkubasi suhu 50°C dengan 2% SDS). Setelah pengupasan, membran dapat melewati blocking kembali untuk pemeriksaan yang baru. Pengupasan memiliki kemungkinan tidak konsisten di seluruh membran, sehingga blot probing berulang tidak boleh digunakan untuk semikuantifikasi dan hasil harus dianalisis dengan hati-hati.

Referensi:

1. Mahmood T, Yang PC. Western blot: technique, theory, and troubleshooting. N Am J Med Sci. 2012 Sep;4(9):429-34.
2. Kurien BT, Scofield RH. Western blotting: an introduction. Methods Mol Biol. 2015;1312:17-30.
3. Hnasko TS, Hnasko RM. The Western Blot. Methods Mol Biol. 2015;1318:87-96.
4. Gavini K, Parameshwaran K. Western Blot. 2023 Apr 14. In: Stat Pearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2023 Jan–.
5. Mishra M, Tiwari S, Gomes AV. Protein purification and analysis: next generation Western blotting techniques. Expert Rev Proteomics. 2017 Nov;14(11):1037-1053.
6. Jalali M, Saldanha FYL, Jalali M. 2017. Basic Science Methods for Clinical Researchers. Academic Press.

Artikel terkait:

1. Mengenal Western Blot Bersama Solarbio Life Science (Link)
2. Introduksi Flow Cytometer dan Prinsip Kerjanya [Link]
3. Bagaimana Memilih Antibodi untuk Flow Cytometry [Link]
4. Aplikasi Metode Flow Cytometry dan Perkembangan Jenis Assay [Link]
5. Prosedur Flow Cytometry dan Seleksi Jenis Antibodi Flow Cytometry [Link]
6. Introduksi Teknik Imunofluoresensi dengan Immunofluorescence Kit [Link]
7. Mengenal Praktek dan Prosedur Teknik Imunofluoresensi (IF) [Link]
8. IHC 1: Ready-to-Use Antibodies untuk IHC merk Elabscience® [Link]
9. IHC 2 : Panduan Imunohistokimia (IHK) untuk Preparat Paraffin [Link]
10. Memilih Antibodi Primer atau Sekunder [Link]