MSI-H+ telah menjadi biomarker prediktif dan prognostik untuk respon imunoterapi kanker dan statusnya telah terdeteksi pada berbagai jenis kanker. Terdapat beberapa metode pengujian klinis MSI-H+ yang saat ini digunakan, antara lain berbasis PCR tradisional (polymerase chain reaction), imunohistokimia (IHC) dan NGS (next-generation sequencing).

Mikrosatelit dan Microsatellite Instability (MSI)

Mikrosatelit adalah array (susunan) tandem atau pengulangan 1–6 bp yang dikenal sebagai short tandem repeats (STR), sedangkan minisatelit dikenal sebagai variable number tandem repeats (VNTR) dengan ukuran lebih panjang (10-100 bp). Mikrosatelit sering kali tersusun dalam string panjang dan terlokalisasi di intron, serta dipengaruhi oleh peristiwa mutasi seperti insersi dan delesi. Karena variasi jumlah bp (base pair) setiap individu berbeda, mikrosatelit dapat digunakan sebagai “marker polimorfik”. Saat modifikasi tersebut terjadi di dalam atau di dekat suatu gen dapat mengarah pada perubahan fungsi produk gen (secara menguntungkan atau merugikan) sehingga bertindak sebagai regulator ekspresi gen.

Tumor Microsatellite instability (MSI) mengalami hipermutasi dan mengekspresikan banyak peptida yang berfungsi sebagai neoantigen yang menguntungkan bagi lingkungan mikro tumor. Kanker MSI telah terbukti mengekspresikan protein checkpoint kadar tinggi, diantaranya PD-1, PD-L1, CTLA 4, LAG-3 dan IDO. Individu dengan tumor MSI memiliki kemungkinan besar merespons antibodi anti-PD-1, meskipun beberapa kasus tidak berkaitan dengan MSI.

Microsatellite instability kadar tinggi (MSI-H+) didefinisikan sebagai mutasi germline atau somatik (diwariskan atau didapat) pada protein DNA mismatch repair (MMR) yang spesifik  menyebabkan ekspansi dan/atau kontraksi sekuens DNA berulang tersebut. Mismatch repair tidak sempurna menyebabkan beban mutasi tumor tinggi dan pembentukan neoantigen banyak yang dapat dikenali oleh sistem imun. Sel kanker dengan ekspresi PD-L1 (programmed death-ligand 1) tinggi, yaitu ligan PD-1 (programmed death receptor-1), mampu menghindari deteksi dan eliminasi oleh sistem imun adaptif. Pemblokiran interaksi PD-1/PD-L1 akan menjadikan sistem imun menyerang sel kanker yang sebelumnya tidak terlihat. Terdapat korelasi positif antara status MSI-H+ dan peningkatan ekspresi PD-1/PD-L1, serta antara status MSI-H+ dan beban mutasi tumor secara keseluruhan.

Metode-Metode Pendeteksian MSI

Beberapa tahun yang lalu, deteksi MSI dari spesimen tumor mengandalkan deteksi imunohistokimia (MSI-IHC) dari empat protein MMR (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2). Salah satu kelemahan utama MSI-IHC adalah ketidakmampuan mendeteksi MSI yang disebabkan oleh mutasi titik atau insersi/delesi kecil pada protein MMR yang umumnya masih dapat menunjukkan hasil IHC positif. Metode kedua deteksi MSI yaitu berbasis PCR terhadap lima lokus mikrosatelit standar (MSI-PCR) (panel Bethesda) atau delapan lokus (panel Promega®). Kelemahan utama dari MSI-PCR adalah keterbatasan jumlah lokus MSI yang dievaluasi berkisar 5–8 lokus saja. Pengujian MSI-IHC dan MSI-PCR awalnya ditujukan dalam diagnosis defisiensi mismatch repair bawaan atau sindrom Lynch. Sebagian sindrom Lynch mencakup kanker kolorektal dan rahim, sehingga adanya bias untuk kedua jenis kanker berikut perlu diperhatikan. Metode terbaru pendeteksian MSI yaitu menggunakan NGS (next-generation sequencing) terintegrasi ditujukkan untuk mengatasi limitasi MSI-IHC dan MSI-PCR. Metode komputasi NGS terbaru dikembangkan untuk mendeteksi MSI-H+ dengan target  hingga ribuan lokus mikrosatelit. Berikut panel-panel gen NGS yang telah dikomersialisasikan dalam deteksi MSI-H+ meliputi, MSIPlus, mSINGS, ColoSeq, Sensor MSI dan MANTIS. Dikarenakan signifikansi dan validasi MSI-H+ sebagai biomarker prediktif, metode MSI-H+ mungkin akan menjadi metode pengujian klinis terstandar dalam perawatan rutin pasien kanker dalam beberapa tahun mendatang.

Imunohistokimia IHC dan Protein MMR

Terdapat dua jenis DNA mismatches dalam mikrosatelit yaitu mismatch basa/basa dan eror replikasi dengan delesi atau insersi (indel). Sekuens DNA mismatched dapat diidentifikasi dan dikoreksi oleh mismatch repair protein (MMR) dan pada mamalia meliputi protein MSH2, MSH3, MSH6, MLH1, PMS2 serta protein lainnya termasuk DNA polimerase dan ligase, EXO1, PCNA, RFC dan regulasi PPA. Protein MSH2, MSH3 dan MSH6 mengenali dan mengikat sekuens DNA mismatched dan membentuk kompleks heterodimer, sedangkan protein MLH1 dan PMS2 menghilangkan nukleotida mismatched. Hilangnya satu atau lebih protein MMR biasanya terjadi karena hipermetilasi promotor MLH1 dengan silencing epigenetik ataupun karena mutasi gen pengkode protein tersebut. Akibat kehilangan tersebut, akumulasi error replikasi DNA di area sekuens DNA pendek berulang yang dikenal sebagai microsatellite instability seperti yang dijelaskan diatas.

Imunohistokimia (IHC atau IHK) merupakan metode andal dan relatif hemat biaya untuk pengujian molekuler berdasarkan deteksi protein MMR dalam sel tumor. Reaksi IHC harus dilakukan pada jaringan terfiksasi dan biopsi pra-operasi. Protein MMR pada bagian yang distaining menunjukkan pola ekspresi inti yang harus dibandingkan sel mukosa normal dan sel inflamasi stroma, khususnya limfosit, sebagai kontrol internal positif untuk interpretasi yang tepat. Pola staining sitoplasma atau membran harus dianggap sebagai artefak. Pada IHC rutin, empat protein MMR (MLH1, MSH2, MSH6, PMS2) adalah marker yang paling informatif dan umum digunakan untuk evaluasi defisiensi mismatch repair pada berbagai jenis tumor.

Human MutL Homolog 1 (MLH1)

Human MutL Homolog 1 (MLH1) adalah protein MMR yang dikodekan oleh gen supresor tumor MLH1 berlokasi pada kromosom 3. MLH1 melakukan heterodimerisasi dengan PMS2, PMS1 atau MLH3, masing-masing membentuk MutLα, MutLβ atau MutLγ. Pada tumor yang diperiksa dengan IHC, hilangnya MLH1 biasanya berhubungan dengan hilangnya PMS2 disebabkan inaktivasi gen MLH1 oleh promotor atau mutasi gen ter-hipermetilasi. Hilangnya MLH1 dan PMS2 tanpa adanya hipermetilasi promotor MLH1 dapat bersifat sporadis (mutasi diperoleh dan tidak bawaan). Hilangnya keduanya yang berkaitan dengan hipermetilasi promotor gen MLH1 dianggap sporadis.

Human MutS Homolog 2 (MSH2)

Human MutS Homolog 2 (MSH2) merupakan protein MMR yang dikodekan pada kromosom 2 dan melakukan heterodimerisasi dengan MSH6 atau MSH3 untuk masing-masing membentuk kompleks MutSα atau MutSβ. Kompleks ini mengenali dan berikatan dengan dsDNA mismatched untuk memulai perbaikan DNA tersebut. Pada umumnya, hilangnya MSH2 diakibatkan mutasi pada gen MSH2 atau hipermetilasi promotor. Hilangnya MSH2 juga umumnya berhubungan dengan hilangnya MSH6.

Human MutS Homolog 6 (MSH6)

Human MutS Homolog 6 (MSH6) adalah protein MMR yang dikodekan pada kromosom 2 yang melakukan heterodimerisasi dengan MSH2 untuk membentuk kompleks MutSα. Hilangnya ekspresi MSH6 dapat ditemukan pada tumor setelah terapi neoadjuvan yang menyebabkan hasil palsu.

PMS1 Homolog 2 (PMS2)

PMS1 Homolog 2 (PMS2) adalah endonuklease mismatch repair yang dikodekan pada kromosom 7. Aktivitas endonuklease PMS2 menyebabkan putusnya untai tunggal dekat basa mismatched, menghadirkan titik masuk bagi eksonuklease EXO1 untuk mendegradasi sekuens DNA mismatched. Hilangnya PMS2 biasanya dikaitkan dengan hilangnya MLH1.

Tabel 1. Panel Protein MMR dan IHC Kit

Tabel 2. Reagen dalam metode IHC

Polymerase Chain Reaction (PCR) MSI

MSI juga dapat dideteksi menggunakan metode PCR melalui amplifikasi daerah DNA genom yang mengandung pengulangan mikrosatelit diikuti dengan pemisahan elektroforesis dari fragmen PCR. DNA genom diisolasi dari jaringan normal dan tumor dengan metode isolasi DNA FFPE. Isolat DNA diamplifikasi menggunakan PCR dengan primer berlabel fluoresen. Panel Bethesda (Bethesda panel) merupakan penel 5 lokus mikrosatelit yang direkomendasikan secara klinis, meliputi 3 marker ulangan dinukleotida (D2S123, D5S346, D17S250) dan 2 marker ulangan mononukleotida (BAT25, BAT26).

Isolasi DNA Genom dari Jaringan

DNA Formalin-Fixed Paraffin-Embedded (FFPE) kit komersial dapat digunakan untuk mengisolasi DNA genom dari jaringan. Komponen kit isolasi DNA FFPE umumnya meliputi spin column, tabung koleksi, larutan deparafinisasi, uracil N-glycosylase, air RNase-free RNase A dan larutan-larutan buffer.

Tabel 3. Kit isolasi DNA dari jaringan parafinasi

Polymerase Chain Reaction (PCR) Marker Mikrosatelit

Lima lokus panel Bethesda yang telah diketahui diamplifikasi dengan single multiplex PCR  menggunakan Type-it Microsatellite PCR (Qiagen #206243) yang berisi reagen yang siap pakai dan buffer PCR inovatif spesifik untuk deteksi mikrosatelit dan minisatelit dengan PCR multipleks. Kit berikut mampu menghasilkan amplifikasi yang sangat spesifik pada semua lokus secara bersamaan. Berikut primer-primer yang digunakan untuk amplifikasi marker ulangan sekuens sederhana:

Tabel 4. Primer-primer untuk 5 lokus mikrosatelit panel Bethesda

Setelah denaturasi dari PCR selesai dilakukan, pemisahan elektroforesis produk PCR dilakukan pada sequencer DNA elektroforesis berbasis kapiler secara otomatis. Data luaran dianalisis dengan program software genotyping otomatis untuk peaks puncak dalam elektroferogram berdasarkan ukurannya dan membuat allele calls melalui perbandingan ukuran terhadap allelic ladder (software GeneMapper atau setara).

Pola alel yang diamplifikasi pada jaringan normal dan tumor dibandingkan untuk mengidentifikasi insersi atau delesi unit ulangan dalam kedua jenis jaringan. Dengan demikian, microsatellite instability ditentukan dengan perbandingan sampel DNA yang diamplifikasi pada tumor dan jaringan normal sesuai yang memungkinkan identifikasi kontraksi atau ekspansi ulangan mikrosatelit dengan konsekuensi adanya perubahan panjang mikrosatelit dalam sampel.

Berdasarkan penggunaan panel Bethesda, kondisi MSI-H (tinggi) yaitu saat dua atau lebih dari lima marker (dimana ukuran panjang mikrosatelit akan berbeda antara sampel tumor dan sampel normal), sedangkan MSI-L (rendah) yaitu hanya satu marker lokus yang terdeteksi. Status MSS (non-MSI) ditetapkan saat lima marker tidak menunjukkan ketidakstabilan.

Baru-baru ini, pembaruan sensitivitas dalam deteksi MSI dengan perluasan panel Bethesda dengan 8 lokus mikrosatelit dan 2 marker homopolimer (BAT25, BAT26, D5S346, D17S250, D2S123, TGFB, BAT40, D18S58, D17S787, D18S69) diusulkan untuk menilai MSI dalam ranah diagnostik. Selain itu, protokol PCR dengan 10 mikrosatelit juga telah dikenalkan dengan marker sebagai berikut: BAT25, BAT26, BAT40, D2s123, D10s197, D13s153, D17s250, D18s58, D5s346, dan MycI. Namun, pertimbangan tumor MSI tetap berdasarkan kesepakatan bahwa dua atau lebih marker panel Bethesda bermutasi.

Referensi

1. Palmieri G, Casula M, Manca A, Palomba G, Sini MC, Doneddu V, Cossu A, Colombino M. Genetic Instability Markers in Cancer. Methods Mol Biol. 2020;2055:133-154.
2. Muin S. A. Tuffaha, Hans Guski, Glen Kristiansen. Immunohistochemistry and Biomarkers for Targeted Tumor Therapy. Immunohistochemistry in Tumor Diagnostics. Springer International Publishing. 2023:349-355.
3. Kerr, S.E. & Shahi, M.. (2024). Molecular testing in gynecologic cancer.
4. Bonneville R, Krook MA, Chen HZ, Smith A, Samorodnitsky E, Wing MR, Reeser JW, Roychowdhury S. Detection of Microsatellite Instability Biomarkers via Next-Generation Sequencing. Methods Mol Biol. 2020;2055:119-132.