Imunohistokimia (IHC) merupakan teknik yang sangat berperan penting untuk mendeteksi dan mengukur epitop target (misalnya protein, struktur, komponen seluler) dalam berbagai jenis jaringan. Pewarnaan IHC dapat diterapkan pada sampel segar, beku, dan FFPE (Formalin-Fixed Paraffin-Embedded), menggunakan antibodi dengan spesifisitas tinggi untuk memvisualisasikan pola ekspresi target, yang memberikan informasi kuantitatif, kualitatif, dan spasiotemporal tentang proses yang terjadi dalam jaringan. Dalam kesempatan ini akan kami ulas mengenai tahapan pengerjaan IHC tradisional yang telah dilakukan sebelumnya dari Laboratorium Elabscience.

Tahapan Imunohistokimia (IHC)

A.  Preparasi Slide paraffin

1. Gunakan pensil untuk menuliskan informasi pada sisi kanan slide, bagian slide yg kosong, berisi keterangan nama Antibodi, no. serial, tanggal eksperimen, dilusi antibodi, dan nama jaringan. (sampel berupa jaringan tonsil yang akan diujikan dengan antibody Ki67.
2. Letakkan slide sampel pada rack slide, menghadap ke arah yang sama.
3. Letakkan rack slide pada oven dengan suhu 60℃ (set 55-60℃) selama 15-20 menit. Tujuan dari tahap ini agar jaringan menempel pada slide.
   Note: Waktu inkubasi dapat lebih namun tidak melebihi 1 jam.

Elabscience mensuplai Antibody Ki-76 ready to use (Sudah terlarutkan siap pakai) untuk aplikasi IHC dengan katalog sebagai berikut.

Tabel 1. Antibody Ki-67 dari Brand Elabscience

B. Dewax (deparafinasi) dan Rehidrasi

1. Dewaxing: Setelah rack slide sample dikeluarkan dari oven, pindahkan dan rendam slide pada larutan dewax atau xylol I, II, III, masing-masing selama 15 menit.
2. Rehidrasi: Kemudian rendam pada etanol absolut I, II, III, ethanol 95%, ethanol 85% dan ethanol 70% masing-masing selama 5 menit.
3. Setelah dewaxing dan rehidrasi lakukan pembilasan dengan air destil sebanyak 3 kali, masing-masing 3 menit.

Gambar 1. Proses Deparafinasi dan Rehidrasi IHC

Note: pengerjaan Dewaxing dan Rehidrasi dilakukan dalam fume hood atau lemari asam.

C.  Antigen Retrieval

1. Siapkan larutan 0.1M asam sitrat pH 6. 3.4 gram dalam 1L air destil.

Gambar 2. Preparasi Larutan Asam Sitrat

Note: bisa juga pakai EDTA pH 9, digunakan ketika dibutuhkan suhu tinggi (95-100℃), ini biasa digunakan di rumah sakit umumnya yang melakukan pengujian dengan sampel jaringan manusia.

2. Tuang larutan asam sitrat pH 6 pada panci presto kemudian panaskan hingga mendidih.

3. Masukan slide ke dalam panci berisi larutan asam sitrat mendidih kemudian tutup panci.

Gambar 3. Proses Pemanasan Asam Sitrat

4. Tunggu sampai panci presto mengeluarkan uap lalu diamkan selama 2 menit kemudian matikan kompor dan diamkan slide sampai dingin di dalam panci.

Asam sitrat dan EDTA dapat anda temukan di perusahaan kami dengan spesifikasi sebagai berikut.

Tabel 2. Asam Sitrat dan EDTA dari brand SolarBio/Nacalai

D. Inaktivasi

1. Siapkan 3% hidrogen peroksida (H2O2).
Note: siapkan secara fresh saat ingin digunakan dan tidak boleh digunakan dalam jangka waktu yang panjang.

2. Pindahkan slide yang sudah dingin ke dalam PBS, lakukan pencucian sebanyak 3x.

Gambar 4. Proses Pencucian dengan Larutan PBS

3. Setelah pencucian, jaringan pada slide ditandai dengan melingkari sekelilingnya menggunakan histologi marker pen sekitar 2-3 mm dari jaringan.

4. Teteskan 3% H2O2 ke dalam slide sampai menutupi jaringan. Pastikan tidak melebihi lingkaran yang telah dibuat. Diamkan selama 10 menit.

Gambar 5. Penambahan H2O2 pada Slide

5. Lakukan pencucian kembali dengan merendam slide dalam PBS sebanyak 2x.

Dikarenakan proses pencucian yang berulang dan memerlukan larutan PBS yang cukup banyak maka untuk efisiensi reagent dapat menggunakan PBS Tablet / powder. Berikut merupakan pilihan PBS yang dapat anda gunakan.

Tabel 3. PBS Tablet dan Powder dari SolarBio

E. Blocking

1. Angkat slide dari rendaman kemudian teteskan 3% BSA.
2. Inkubasi slide secara horizontal selama 20 menit dalam suhu 37℃.
   Note: inkubasi dengan menambahkan air di bawah slide. Selama inkubasi slide tertutupi oleh penutup box slide.

BSA pada umumnya digunakan sebagai blocking reagent selain diaplikasikan pada IHC juga pada teknik ELISA selain itu juga sebagai standard protein serta banyak aplikasi lainnya. Berikut daftar Produk BSA yang dapat digunakan sesuai dengan kebutuhan riset anda.

Tabel 4. Produk BSA dari Brand SolarBio

F. Inkubasi Antibody Primer

1. Siapkan antibody primer dengan dilusi menggunakan diluent antibody dengan perbandingan 1:1000.
   Note: pengenceran antibodi dapat juga menggunakan 3% BSA.
2. Setelah proses blocking, buang BSA pada slide dan keringkan kemudian tambahkan antibody primer secara merata pada permukaan jaringan di slide yang dilingkari.
   Note: Pengeringan slide tidak boleh menggunakan tissue, ciprat-cipratkan saja slidenya. Penambahan antibody ± 200uL per sampel secara horizontal. Saat menetesi Antibody lakukan dengan cepat sehingga sampel jaringan tidak kering.
3. Inkubasi slide pada suhu 4℃ selama semalam atau 2 jam pada suhu 37℃.
4. Keluarkan slide hingga dingin 15-30 menit untuk mengeluarkan hawa panasnya.
5. Lakukan pencucian dengan PBS 3x, masing-masing selama 3 menit.
6. Rendam dengan PBST 1x selama 5 menit.

Reagen PBST dapat menggunakan produk SolarBio berikut.

Tabel 5. Produk PBST dari Brand SolarBio

G. Inkubasi Antibody Sekunder

1. Setelah pencucian tiriskan slide kemudian tambahkan antibody sekunder ± 100uL. Usahakan tidak keluar dari penanda lingkaran.
2. Inkubasi slide yang telah disimpan pada box slide dengan posisi horizontal pada suhu 37℃ selama 1 jam.
3. Setelah inkubasi selesai lakukan pencucian dengan PBS sebanyak 3x selama masing-masing 3 menit.
4. Rendam dengan PBST 1x selama 3-5 menit.

Elabscience menyediakan juga antibody sekunder / secondary Antibody dari berbagai jenis spesies. Antibody sekunder harus disesuaikan dengan antibody primer yang digunakan dan jenis aplikasinya. Misalnya antibody primer berasal dari host Rabbit maka anda harus memilih Antibody sekundernya, Goat anti Rabbit / Donkey anti Rabbit dan jika anitbody primer anda berasal dari host Mouse makan anda dapat memilih Goat anti Mouse / Human anti mouse, etc. Biasanya juga antibody sekunder telah terkonjugasi dengan enzim yaitu Horseradish Peroxidase (HRP) atau Alkaline Phosphatase (AP). Berikut pilihan antibody sekunder yang dapat menjadi referensi penelitian anda.

Tabel 6. Antibody Sekunder dari Elabscience

H. Deteksi Sinyal / Pembentukan warna

1. Siapkan DAB Substrat secara fresh.
   Note: persiapan dilakukan 5 menit sebelum akan digunakan. DAB Substrat merupakan salah satu Kromogenik dalam IHC.
2. Teteskan DAB substrate ± 200uL pada permukaan jaringan, amati di bawah mikroskop untuk mengamati pengembangan warna, setelah terbentuknya warna (pensinyalan mencapai tertinggi) hentikan pengamatan kemudian bilas menggunakan air destil.
   Note: pengontrolan latar belakang diperlukan selama pembentukan warna.

DAB (3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride) merupakan substrat untuk enzim Horseradish Peroxidase (HRP), selama proses katalisasi HRP, DAB akan menghasilkan endapan berwarna coklat.  Berikut beberapa produk DAB yang dapat menjadi pilihan anda.

Tabel 7. Produk DAB Substrat dari Brand Elabscience

I. Pewarnaan background/latar belakang jaringan

1. Teteskan larutan Hematoxylin Mayer pada irisan jaringan ± 500uL hingga merata, diamkan selama 2 menit, kemudian tiriskan sekitar 1 menit dan bilas dengan air destil untuk menghentikan pewarnaan. Reagen Hematoxylin Mayer dapat anda temukan pada produk SolarBio Cat.#G1080 Mayer’s Hematoxylin Stain Solution，For IHC.

Gambar 6. Penambahan Hematoxylin Mayer

2. Bilas dengan air mengalir selama 5 menit sampai warna kembali biru.

3. Bilas dengan PBS.

J. Penutup slide

1. Lakukan dehidrasi dengan merendam slide dalam alkohol absolut sebanyak 2x selama masing-masing 1 menit. Kemudian tiriskan.
Note: lakukan dehidrasi di dalam lemari asam.

Gambar 7. Proses Dehidrasi Irisan Jaringan

2. Teteskan neutral balsam hingga menutupi seluruh irisan jaringan kemudian tutup menggunakan coverslip. Neutral balsam dapat anda temukan pada Elabscience Cat.#E-IR-R118 Neutral Balsam.

Note: usahakan neutral balsam tidak tumpah dari slide. Saat menutup coverslip harus lurus dan tidak miring serta tidak ada gelembung.

3. Amati preparat di bawah mikroskop

Note: Warna coklat yang terbentuk merupakan target antibody.

Gambar 8. Pengamatan IHC

K. Pencatatan

1. Lakukan pencatatan pada setiap kondisi percobaan, langkah percobaan dan hasil percobaan

Artikel terkait:

1. IHC 1: Ready-to-Use Antibodies untuk IHC merk Elabscience®
2. Memilih Antibodi Primer atau Sekunder
3. Pengenceran Dan Titer Antibodi