Pendahuluan

Dalam bioteknologi dan imunologi, pelabelan antibodi merupakan alat penelitian penting yang mampu untuk mencitrakan beberapa antigen dalam satu sel atau bagian jaringan sehingga memungkinkan banyak eksperimen berharga untuk dilakukan. Pelabelan antibodi dengan biotin dan pewarna fluorescent merupakan teknik penting yang memungkinkan deteksi dan analisis spesifik terhadap molekul target. Kedua metode ini memanfaatkan sifat kimiawi unik dari biotin dan fluorofor untuk meningkatkan sensitivitas dan spesifisitas dalam berbagai aplikasi, termasuk imunohistokimia, flow cytometry, dan analisis protein.

Pelabelan antibodi dengan biotin atau biotinylation adalah proses penambahan biotin pada antibodi dengan cara memanfaatkan interaksi kuat dan spesifik antara biotin dengan streptavidin atau avidin. Interaksi ini memungkinkan deteksi yang sensitif dan stabil, bahkan dalam kondisi ekstrem seperti suhu tinggi atau pH rendah. Metode pelabelan ini dapat dilakukan secara kimiawi menggunakan reagen seperti NHS-biotin atau secara enzimatis menggunakan enzim biotin ligase seperti TurboID, yang menawarkan kemudahan dan efisiensi dalam pelabelan antibodi (Shioya dkk., 2022).

Sementara itu, pelabelan antibodi dengan pewarna fluoresen memungkinkan visualisasi langsung melalui mikroskop fluoresen atau flow cytometry. Protokol pelabelan ini melibatkan konjugasi antibodi dengan fluorofor seperti FITC, Texas Red, atau phycobiliprotein, yang dapat dilakukan melalui reaksi kimia dengan reagen amina-reaktif atau menggunakan bead magnetik seperti Protein A/G untuk meningkatkan efisiensi dan kemurnian antibodi berlabel (Lantz dkk., 2023).

Secara umum, pewarna fluoresen dikovalensikan dengan makromolekul seperti antibodi dan bertindak sebagai molekul pelapor untuk mengukur keberadaan makromolekul tersebut. Reagen bioaktif berlabel fluoresen ini cocok untuk digunakan dalam imunofluoresensi, flow cytometry, dan berbagai aplikasi biologis lainnya. Berbagai pewarna yang banyak digunakan tersedia dalam format yang nyaman. Fluorescein isothiocyanate (FITC) adalah turunan fluorescein yang reaktif terhadap amina dan merupakan salah satu pewarna fluorofor pertama yang banyak digunakan. Derivatif pewarna lain seperti rhodamine (TRITC, TAMRA), coumarin (tersedia sebagai turunan reaktif amina atau karboksil), dan sianin (pewarna polimethin yang dapat digunakan dalam rentang panjang gelombang yang luas) juga umum digunakan. Pewarna fluorofor baru (kebanyakan bersifat proprietari) telah dikembangkan karena kebutuhan akan pewarna dengan kinerja lebih baik di berbagai kondisi biologis dan kimiawi (Berg dan Fishman, 2020)

Tabel 1. Daftar sebagian fluorofor menunjukkan rentang deteksi yang tersedia untuk pelabelan antibodi dengan panjang gelombang eksitasi dan emisi yang dilaporkan (Berg dan Fishman, 2020)

Teknik Pelabelan Antibodi dengan Biotin-probes dan Dye Fluorescent

Pelabelan antibodi dengan biotin dan pewarna fluoresen memberikan kemampuan untuk mendeteksi dan menganalisis molekul target secara spesifik dan sensitif. Teknik-teknik ini memungkinkan visualisasi struktur seluler, identifikasi biomarker penyakit, dan pemahaman interaksi protein dalam berbagai aplikasi penelitian dan diagnostik. Berikut adalah penjelasan mengenai teknik pelabelan antibodi menggunakan biotin-probes dan dye fluorescent.

Pelabelan Antibodi dengan Biotin Probes

Pelabelan antibodi dengan biotin merupakan teknik yang banyak digunakan dalam uji biokimia seperti ELISA, Western blot, dan imunohistokimia, khususnya untuk sistem deteksi streptavidin-biotin. Berikut ini adalah protokol terperinci untuk pelabelan antibodi tersebut.

1. Alat dan Bahan yang diperlukan

• Antibodi (IgG, >1 mg/mL dalam PBS tanpa Tris atau BSA)
• Reagen pelabelan biotin: NHS-Biotin (misalnya, Sulfo-NHS-LC-Biotin – larut dalam air); atau reagen lengan panjang seperti NHS-PEG4-Biotin
• Buffer pelabelan: PBS atau buffer natrium bikarbonat 0,1 M, pH 8,3
• DMSO atau air (tergantung pada jenis biotin)
• Kolom desalinasi (misalnya, Sephadex G-25) atau unit ultrafiltrasi (30 kDa MWCO)
• Tabung mikrosentrifus
• Spektrofotometer (opsional)

2. Persiapan Antibodi

• Konsentrasi: Pastikan ≥1 mg/mL.
• Pertukaran buffer: Jika buffer mengandung amina (misalnya, Tris, glisin, BSA), tukar menjadi buffer bebas amina seperti PBS atau bikarbonat menggunakan kolom desalinasi atau filter putar. Buffer amina akan bersaing dengan biotin untuk situs reaktif NHS.

3. Persiapan Reagen Biotin

• Untuk Sulfo-NHS-LC-Biotin: larutkan dalam air segera sebelum digunakan (misalnya, stok akhir 10 mM).
• Untuk NHS-biotin biasa: larutkan dalam DMSO anhidrat sebelum digunakan.
• Jaga agar larutan tetap dingin dan terlindungi dari cahaya.

4. Reaksi Biotinilasi

• Campur antibodi dan NHS-biotin pada rasio molar 1:10 hingga 1:20 (antibodi:biotin). Titik awal yang baik: 1 mg IgG (~6,7 nmol) + 67–134 nmol biotin
• Inkubasi pada suhu ruangan selama 30–60 menit (terlindung dari cahaya).
• Untuk reagen Sulfo-NHS, reaksi dapat dilakukan langsung dalam buffer berair.

5. Quenching (opsional)

• Tambahkan 1 M Tris-HCl, pH 7,5, hingga konsentrasi akhir 50 mM untuk memadamkan kelebihan biotin.
• Inkubasi selama 10 menit pada suhu ruangan.

6. Pemurnian

• Buang reagen biotin berlebih menggunakan: Kolom desalinasi (misalnya, Sephadex G-25 yang telah diseimbangkan sebelumnya dengan PBS); Kolom spin (batasan 30 kDa) dengan beberapa kali pencucian dalam PBS

7. Penyimpanan

• Simpan antibodi yang terbiotinilasi pada 4°C dalam PBS (tambahkan 0,02–0,05% natrium azida sebagai pengawet).
• Untuk penyimpanan jangka panjang, tambahkan 50% gliserol dan bekukan pada –20°C.

Pelabelan Antibodi dengan Dye-Fluorescent

Pelabelan antibodi dengan pewarna fluoresens merupakan metode umum yang digunakan dalam penelitian biologi untuk aplikasi seperti flow cytometry, immunofluorescence, dan fluorescence microscopy. Berikut ini adalah protokol terperinci untuk pelabelan antibodi dengan pewarna fluoresens (misalnya, pewarna Alexa Fluor, FITC, Cy), yang disusun berdasarkan praktik standar dari publikasi yang ditinjau sejawat seperti yang ada pada beberapa referensi jurnal ilmiah.

1. Alat dan Bahan yang diperlukan:

• • Antibodi (IgG, >1 mg/mL dalam PBS tanpa amina seperti Tris atau BSA)
  • Pewarna fluoresen(diaktifkan oleh NHS-ester, misalnya, Alexa Fluor 488 NHS Ester)
  • Buffer: PBS (pH 7,2–7,5) atau buffer bikarbonat (pH 8,3–8,5)
  • Kolom desalinasi (misalnya, Sephadex G-25) atau kolom putar
  • Dimetil sulfoksida (DMSO) – untuk melarutkan pewarna ester NHS
  • Tabung mikrosentrifus
  • Spektrofotometer atau Nanodrop

2. Persiapan Antibodi

• • Konsentrasi: Pastikan antibodi >1 mg/mL. Jika tidak, konsentratkan menggunakan konsentrator protein.
  • Buffer: Jika antibodi berada dalam penyangga yang mengandung amina (misalnya, Tris, glisin, BSA), tukar dengan PBS atau penyangga natrium bikarbonat 0,1 M menggunakan kolom desalinasi.

3. Persiapan Pewarna

• • Larutkan pewarna ester NHS dalam DMSO anhidrat pada 10 mg/mL atau sesuai petunjuk manufaktur.
  • Gunakan pewarna yang baru disiapkan; ester NHS terhidrolisis dengan cepat dalam air.

4. Reaksi Pelabelan

• • Campurkan antibodi dan pewarna pada rasio molar 1:3 hingga 1:10 (antibodi:pewarna). Titik awal yang umum yakni 100 μg antibodi terhadap 3 – 5 μg pewarna.
  • Inkubasi reaksi dalam gelap pada suhu ruangan selama 1 jam dengan pencampuran yang lembut.

5. Quenching (opsional)

• • Jika pelabelan berlebih menjadi masalah atau jika gugus NHS yang tidak bereaksi bermasalah, tambahkan 1 M Tris-HCl (pH 7,5) ke konsentrasi akhir 50 mM untuk memadamkan pewarna berlebih.

6. Pemurnian
   • Buang pewarna bebas menggunakan: Kolom desalinasi (kolom Sephadex G-25 atau Zeba)** — diseimbangkan dengan PBS; Kolom spin sentrifugal (batas 30 kDa)** — beberapa kali pencucian dengan PBS.
   • Kumpulkan antibodi berlabel fluoresensi dalam tabung bersih.
7. Karakterisasi
   • Ukur absorbansi pada 280 nm (protein) dan λmax khusus pewarna (misalnya, 495 nm untuk Alexa Fluor 488).
   • Hitung derajat pelabelan (DOL) menggunakan:
     
8. Penyimpanan

• • Simpan antibodi berlabel pada 4°C, terlindung dari cahaya.
  • Tambahkan 0,05% natrium azida untuk perlindungan antimikroba.
  • Untuk penyimpanan jangka panjang, bekukan dalam 50% gliserol pada –20°C.

Produk Labeling Kit brand Elabscience

Teknologi pelabelan atau labeling kit adalah teknik yang menandai antibodi/protein/peptida target untuk menampilkan posisi dan kandungan molekul antigen/antibodi dalam sistem reaksi imun dengan lebih baik melalui efek peningkatan dan amplifikasi penanda itu sendiri. Teknik ini dapat digunakan dalam pencitraan sel, flow cytometry, dan aplikasi imunofluoresensi.

Elabscience® menawarkan berbagai kit pelabelan yang memberikan fleksibilitas dalam pelabelan dan hasil yang sangat baik. Elabscience® dapat menawarkan pelabelan fluorokrom dan pelabelan biotin untuk memenuhi kebutuhan Anda akan reagen eksperimental selama proses pelabelan. Adapun keuntungan dari labeling kit brand Elabscience adalah sebagai berikut.

1. Pengoperasian Mudah
   Semua reagen yang diperlukan untuk pelabelan disertakan dalam kit dan reagen mudah dioperasikan.
2. Pelabelan Fleksibel
   Kit ini dapat digunakan untuk pelabelan jejak dan pelabelan massal, menampung jumlah 0,1 hingga 1 mg antibodi setiap kali, dengan berbagai spesifikasi pelabelan opsional yang tersedia.
3. Penerapan Kuat
   Kit ini dapat diterapkan pada sebagian besar protein.
4. Efek Pelabelan yang Sangat Baik
   Rasio pelabelan dioptimalkan untuk meminimalkan risiko pelabelan yang kurang atau inaktivasi karena pelabelan yang berlebihan, sehingga menghasilkan hasil pelabelan yang lebih efektif.

Berikut adalah produk Labeling Kit dari brand Elabscience.

Produk Elabscience untuk dye-fluorescent labeling adalah sebagai berikut.

Untuk pertanyaan produk dan stock lebih lanjut Bapak/Ibu dapat menghubungi kami PT. Indogen melalui email sales.indogen@gmail.com atau melalui WhatsApp berikut untuk fast respon WhatsApp Indogen.

Referensi :

• Berg, E. A., & Fishman, J. B. (2020). Labeling Antibodies. Cold Spring Harbor protocols, 2020(7), 099242. https://doi.org/10.1101/pdb.top099242
• Haugland, R. P. (2005). The Handbook—A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies. Invitrogen.
• Hermanson, G. T. (2013). Bioconjugate Techniques, 3rd ed. Academic Press. Lantz, L., Holmes, K., & Douagi, I. (2023). Conjugation of Fluorochromes to Monoclonal Antibodies. Current protocols, 3(6), e795. https://doi.org/10.1002/cpz1.795
• Mujumdar, R. B., et al. (1993). “Cyanine dye labeling reagents: sulfoindocyanine succinimidyl esters.” Bioconjugate Chemistry, 4(2), 105–111.
• Shioya, R., Yamada, K., Kido, K., Takahashi, H., Nozawa, A., Kosako, H., & Sawasaki, T. (2022). A simple method for labeling proteins and antibodies with biotin using the proximity biotinylation enzyme TurboID. Biochemical and biophysical research communications, 592, 54–59. https://doi.org/10.1016/j.bbrc.2021.12.109
• Smith, G. P. & Zopf, D. A. (2004). “Biotin labeling of antibodies for immunoassays.” Journal of Immunological Methods, 284(1–2), 99–109.
• Waggoner, A. (2006). “Fluorescent labels for proteomics and genomics.” Current Opinion in Chemical Biology, 10(1), 62–66.
• Wilchek, M., & Bayer, E. A. (1988). “The avidin-biotin complex in bioanalytical applications.” Analytical Biochemistry, 171(1), 1–32.

Artikel Terkait

1. https://indogen.id/peran-peran-metode-flow-cytometry-dalam-integrasi-teknik-deteksi-laboratorium/
2. ://indogen.id/bagaimana-cara-mengisolasi-sel-tunggal-dari-jaringan-kanker-pankreas-menggunakan-flow-cytometry/
3. https://indogen.id/bagaimana-cara-mengisolasi-mesenchymal-stem-cell-msc-dengan-flow-cytometry/
4. https://indogen.id/bagaimana-cara-isolasi-karakterisasi-dan-proliferasi-sel-kanker-payudara-menggunakan-flow-cytometry/
5. https://indogen.id/jalur-kematian-sel-apoptosis-nekrosis-necroptosis-pyroptosis-serta-cara-dan-kit-deteksinya/