Radikal Bebas dan ROS
Radikal bebas dan spesies oksigen reaktif (ROS) adalah istilah umum untuk molekul yang memiliki keterkaitan dengan perkembangan dan patofisiologi penyakit kanker, diabetes, hepatotoksisitas, nefrotoksisitas, osteoartritis, dan penyakit parah lainnya. ROS seperti oksigen singlet dan radikal bebas biasanya dihasilkan di lingkungan ekstraseluler dan intraseluler selama proses metabolisme dan reaksi transfer elektron. Ketika konsentrasi ROS melebihi keseimbangan normal, ROS akan berusaha mengambil elektron dari komponen sel yang paling rentan, misalnya membran lipid. Peningkatan konsentrasi ROS secara tiba-tiba adalah kondisi yang sering disebut dengan stres oksidatif.

Artikel terkait:
1. Uji Aktivitas Antioksidan dengan Metode DPPH [link]
2. Kenapa Stress Oksidatif Sangat Penting? [link]
3. Pengukuran Berbagai Marker Enzim dari Merk Elabscience [link]
4. Kit Stress Oksidatif dari Cayman Chemical Bag. 1 – Peroksidasi Lipid [link]
5. Kit Stress Oksidatif dari Cayman Chemical Bag 2 – Oksidasi dan Nitrasi Protein [link]
6. Kit Stress Oksidatif dari Cayman Chemical Bag. 3 – Kerusakan DNA dan RNA [link]

Sangat penting bagi sistem tubuh untuk selalu menjaga keseimbangan konsentrasi ROS intraseluler dan ekstraseluler. Jumlah ROS yang diproduksi dan dieliminasi dikendalikan oleh beberapa faktor lingkungan seluler. Faktor-faktor tersebut berasal dari molekul antioksidan dan enzim antioksidan. Molekul antioksidan dapat menyumbangkan elektron tanpa kehilangan stabilitasnya. Antioksidan di lingkungan seluler mencegah ROS mencuri elektron dari struktur seluler, sehingga antioksidan diperlukan dalam kadar memadai untuk melawan stres oksidatif. Antioksidan alami mamalia yaitu, bilirubin, tiol seperti glutation tereduksi (GSH), beberapa kelas vitamin dan mineral dari polifenol makanan dan sebagainya.

Enzim antioksidan memiliki kemampuan menstabilkan dan/atau menonaktifkan radikal bebas sebelum molekul-molekul tersebut menyerang komponen seluler. Enzim-enzim ini mampu mengurangi energi radikal bebas atau dengan melepaskan sebagian elektron dari molekul radikal, disamping juga dapat mengganggu reaksi berantai pengoksidasi untuk meminimalkan kerusakan selular. Dengan demikian, enzim antioksidan sangat penting untuk menjaga kesehatan seluler dan sistemik untuk tetap optimal.

1. Superoksida dismutase

Superoksida dismutase (SOD) adalah enzim mengkatalisis dismutasi anion superoksida yang sangat reaktif menjadi O2 dan radikal kurang reaktif seperti peroksida (H2O2). Peroksida selanjutnya dapat dieliminasi oleh reaksi CAT atau GPX. Terdapat tiga bentuk SOD yang ditemukan pada manusia, yaitu Cu/Zn-SOD di sitosol, Mn-SOD di mitokondria dan SOD ekstraseluler (EC-SOD). SOD mengeliminasi O2- dengan oksidasi dan reduksi berturut-turut dari ion logam transisi pada situs aktif enzim dengan laju reaksi yang sangat tinggi. Semua jenis SOD dapat berikatan dengan anion bermuatan tunggal, seperti azida dan fluorida.

O2− + O2− + 2H+ →SOD→ H2O2 + O2

Enzim ini dapat membantu peremajaan, perbaikan sel dan mengurangi kerusakan selular oleh stres oksidatif. SOD dapat dijumpai di kulit terutama di fibroblas. Sumber alami SOD yang umum adalah kubis, kubis Brussel, rumput gandum, rumput barley, dan brokoli. Selain itu, SOD juga mampu mencegah penyakit Lou Gehrig atau Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), menanggulangi inflamasi, luka bakar, masalah prostat, radang sendi, ulkus kornea serta mampu memerangi efek radikal bebas yang menyebabkan folikel rambut mati.

The reaction of CAT occurs in two steps. A molecule of hydrogen peroxide oxidizes the heme to an oxyferryl species. A porphyrin cation radical is generated when one oxidation equivalent is removed from iron and one from the porphyrin ring. A second hydrogen peroxide molecule acts as a reducing agent to regenerate the resting state enzyme, producing a molecule of oxygen and water.

2. Katalase
Katalase (CAT) adalah enzim berperan dalam degradasi hidrogen peroksida dan merupakan enzim protektif yang dapat ditemukan hampir di semua sel hewan. CAT mengandung satu gugus ferriprotoporphyrin per subunit dan bereaksi sangat efisien dengan H2O2 untuk membentuk air dan molekul O2 dengan donor H (metanol, etanol, asam format, atau fenol) dengan aktivitas peroksidase.

Reaksi CAT terjadi dalam dua langkah:

• Molekul H2O2 mengoksidasi heme menjadi spesies oxyferryl, yaitu radikal kation porfirin dihasilkan ketika satu ekuivalen oksidasi dihilangkan dari besi dan satu lagi dari cincin porfirin
• Molekul H2O2 kedua bertindak sebagai zat pereduksi untuk meregenerasi enzim keadaan istirahat dan menghasilkan molekul O2 dan air

2H2O2 → 2H2O + O2

ROOH + AH2 → H2O + ROH + A

Pada hewan, H2O2 didetoksifikasi oleh CAT dan GPX. CAT melindungi sel dari peroksida yang dihasilkan, meskipun enzim ini tidak esensial untuk beberapa jenis sel. CAT berperan penting dalam adaptasi toleransi stres oksidatif sel. Aplikasi CAT juga digunakan dalam industri makanan untuk menghilangkan H2O2 dari susu sebelum produksi keju dan pembungkus makanan untuk mencegah oksidasi makanan. Selain itu, CAT juga digunakan dalam industri tekstil, menghilangkan H2O2 dari kain untuk memastikan bahan tersebut bebas peroksida.

3. Glutathione peroksidase
Glutathione peroxidase (GPx) adalah enzim yang bertugas melindungi sel dari kerusakan akibat H2O2 dan peroksida lipid. GPx memiliki residu selenocysteine (Sec) tunggal di empat subunit identik yang penting untuk aktivitas enzim tersebut. GPX mengkatalisis reduksi hidroperoksida menggunakan GSH.

ROOH + 2GSH → ROH + GSSG + H2O

Terdapat lima isoenzim GPx yang telah diidentifikasi pada mamalia. Kadar masing-masing isoform bervariasi berdasarkan jenis jaringan, meskipun jenis isoform tidak spesifik pada satu organ/jaringan:

• cGPX atau GPX1
• GPX2 atau GPX-G1
• GPX3 atau GPX-P
• PHGPX atau GPX4
• GPX5

Kadar GPx dalam tubuh bergantung pada kadar glutathione sebagai antioksidan utama tubuh. Glutathione (GSH) merupakan tripeptida melindungi sel dari dampak negatif polusi dan menguatkan sistem imunitas tubuh. Peran antioksidan GSH sangat penting bagi otak karena otak sangat sensitif terhadap keberadaan radikal bebas. Kombinasi konsumsi makanan yang mengandung GSH, vitamin C, vitamin E, selenium dan GPX sangat efektif untuk mengatasi stres oksidatif.

4. Xanthine Oxidase (XO)
Xanthine oxidase (XO) adalah enzim terdistribusi pada jaringan mamalia dan dapat diderivasi dengan proses oksidasi sulfhidril reversibel atau pembelahan proteolitik ireversibel dari xanthine dehydrogenase (XDH) pada kondisi stres selular. XO menghasilkan ROS dengan mengkatalisis oksidasi hipoxantin menjadi xantin, dan selanjutnya mengkatalisis oksidasi xantin menjadi asam urat. XO memanfaatkan O2 dan purin untuk memproduksi H2O2 dan asam urat melalui hidroksilasi oksidatif. Enzim ini berperan penting dalam perkembangan dan perkembangan berbagai kanker. XO dan XDH adalah isoenzim xantin oksidoreduktase (XOR).

Seperti aldehid oksidase dan enzim dengan molibdenum, XO mengkatalisis oksidasi nukleofilik pada karbon kekurangan elektron yang ditemukan dalam senyawa heterosiklik yang mengandung nitrogen. Kadar XO paling tinggi ditemukan di hati, meskipun juga ditemukan di jaringan jantung, paru, adiposa dan kelenjar mamae. Di dalam jaringan-jaringan tersebut, XO berlokasi dalam sel endotel kapiler. Aktivitas XO vaskular diregulasi oleh NAD(P)H oksidase, karena penghasilan H2O2 oleh NADPH merangsang aktivitas XO. Sehingga dapat dibayangkan bahwa pembentukan ROS seluler dari satu sumber enzim dapat menghasilkan ROS dari sumber lainnya. Aktivitas XO vaskular berkorelasi terbalik dengan fungsi endotel pada pasien dengan gagal jantung dan aterosklerosis.

Kurkumin dilaporkan menghambat aktivasi XO yang diinduksi PMA. Penelitian komputasi dan docking molekuler menunjukkan bahwa kurkumin dapat berinteraksi langsung dengan XO dengan mengikat XO pada residu Phe914, Phe1009, dan Thr1010, sehingga menurunkan aktivitas enzim tersebut. Metabolit kurkumin terbukti mengikat XO lebih efisien daripada kurkumin.

Hipoxantin akan dioksidasi oleh XO untuk menghasilkan xantin dan anion super oksidatif, yang akan dengan cepat diubah menjadi H2O2 dalam sistem. Kemudian, H2O2 dapat mengoksidasi probe non-fluoresen menjadi zat fluoresen. Dengan mengukur nilai fluoresensi tersebut, aktivitas xantin oksidase dapat dihitung.

5. Glukosa-6 fosfat dehidrogenase (G6PDH)
Glukosa-6 fosfat dehidrogenase (G6PDH) adalah enzim yang bergantung pada NADP dan enzim pertama pada jalur pentosa fosfat, yaitu jalur alternatif metabolisme glukosa untuk produksi NADPH yang diperlukan untuk sintesis molekul lainnya.. Dehidrogenasi glukosa-6 fosfat menjadi 6-fosfoglukonat terjadi melalui pembentukan 6-fosfoglukonolakton yang dikatalisis oleh G6PDH, Reaksi tersebut terjadi di sitosol.

Jalur pentosa fosfat merupakan sumber penting NADPH dalam pertahanan stres oksidatif karena digunakan oleh sel untuk mengubah glutation teroksidasi (GSSG) menjadi glutathione (GSH). Cabang oksidatif dari jalur pentosa fosfat mengandung dua enzim yang menghasilkan NADPH dari NADP+, G6PDH dan 6-fosfoglukonat dehidrogenase (PGD). Mutasi G6PD kehilangan fungsi pada orang dewasa dapat ditoleransi dengan baik, meskipun menyebabkan eritrosit rentan terhadap hemolisis dari stres oksidatif. Beberapa studi telah melaporkan insiden dan kematian lebih rendah untuk pasien kanker tertentu pada orang dengan mutasi polimorfik pada G6PD, menunjukkan bahwa sel kanker membutuhkan G6PD untuk mengelola stres oksidatif.

6. Deteksi Enzim Antioksidan
Berikut Assay kit dalam deteksi molekul yang berperan dan berkontribusi selama stres oksidatif pada tanaman.

Tabel 1. Assay kit dari Elabscience untuk deteksi enzim antioksidan pada mamalia

Referensi:

1. Krishnamurthy P., Wadhwani, A. 2012. Antioxidant Enzymes and Human Health’, in M. A. El-Missiry: Antioxidant Enzyme, IntechOpen, London.
2. Ma J, Yang L, Ren JF, Yang J. 2018. Autophagy, Oxidative Stress, and Redox Regulation. Proceeding.
3. Shehzad A, Shahzad R, Lee YS. 2014. Chapter Eight – Curcumin: A Potent Modulator of Multiple Enzymes in Multiple Cancers. Editor(s): S. Zahra Bathaie, Fuyuhiko Tamanoi. The Enzymes. Academic Press. Volume 36. pp. 149-174.
4. Aurora AB, Khivansara V, Leach A, Gill JG, Martin-Sandoval M, Yang C, Kasitinon SY, Bezwada D, Tasdogan A, Gu W, Mathews TP, Zhao Z, DeBerardinis RJ, Morrison SJ. 2022. Loss of glucose 6-phosphate dehydrogenase function increases oxidative stress and glutaminolysis in metastasizing melanoma cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 119(6):e2120617119.
5. Bhardwaj, S. B. 2013. Alcohol and Gastrointestinal Tract Function. Bioactive Food as Dietary Interventions for Liver and Gastrointestinal Disease, 81–118.