1. Metabolisme Protein Pada Jaringan Tubuh

• Sintesis Protein
  Sintesis protein pada dasarnya adalah proses translasi mRNA menjadi peptida fungsional. Sintesis protein merupakan proses inti dari regulasi seluler seluruh tubuh. Sintesis protein dapat distimulasi atau diinhibisi sebagai respons terhadap rangsangan endogen dan eksogen. Protein berfungsi sebagai enzim, transporter, hormon, dan antibodi serta mampu menunjang fungsi keseimbangan cairan dan elektrolit, keseimbangan asam-basa, produksi energi, pertahanan kekebalan, dan pertumbuhan, pemeliharaan, dan perbaikan sel. Dengan demikian, gangguan sintesis protein dapat menyebabkan perkembangan penyakit hingga kematian.
• Katabolisme Protein
  Proteolisis atau degradasi protein intraseluler adalah proses degradasi molekul oleh enzim protease. Situs target proteolitik suatu molekul substrat ditentukan oleh spesifisitas protease dan fleksibilitas situs dari substrat tersebut. Aktivitas proteolitik ditentukan oleh faktor suhu, pH, ion logam dan bagian terdenaturasi dari substrat. Semakin tinggi konsentrasi protease dan substrat, semakin cepat laju proteolisis yang terjadi sehingga menyebabkan inaktivasi. Berikut beberapa peran proteolisis pada tubuh:
  • Terlibat dalam respon imun dan eliminasi patogen
  • Mampu secara cepat menghilangkan protein abnormal atau rusak serta mencegah akumulasinya
  • Degradasi protein menyediakan asam amino bebas yang dapat digunakan sebagai sumber energi atau untuk sintesis protein penting lainnya
  • Mengubah kadar protein fungsional secara cepat, menyebabkan penyesuaian metabolisme sel sebagai respons terhadap tantangan apa punTerdapat setidaknya lima sistem proteolitik utama pada tubuh, antara lain sistem proteolisis lisosom, -bergantung Ca21, -bergantung caspase, -bergantung ubiquitin-proteasome dan metalloproteinase. Meskipun kelima proteolisis ini dapat dijumpai pada semua jaringan tubuh, fungsi relatif utama dari setiap jalur tersebut bervariasi pada jaringan atau organ tertentu, tergantung pada faktor intrinsik dan ekstrinsik (status kesehatan, genetika, olahraga, kebiasaan diet dll).

I. Proteolisis Bergantung Ca21
Protease sistein yang disebut calpain merupakan enzim utama degradasi protein. Calpain tersebar di berbagai jaringan dan ikut andil dalam peristiwa proteolitik terbatas. Aktivitas calpain berperan dalam proses fisiologis dan patologis, seperti motilitas sel dengan merombak kompleks sitoskeleton, kontrol siklus sel, atau apoptosis.

II. Caspase
Caspase adalah protease sistein yang fungsinya berhubungan dengan kematian sel terprogram atau apoptosis. Pembelahan proteolitik caspase menghasilkan perubahan morfologi sel seperti blebbing membran, fragmentasi DNA, paparan fosfatidilserin pada permukaan sel, dan pembentukan vesikel apoptosis. Peran caspase dalam proteolisis otot berhubungan dalam disorganisasi struktur myofibrillar otot rangka. Caspase juga dilaporkan memiliki beberapa fungsi di luar proses apoptosis, misalnya, inflamasi, nekroptosis, imunitas, diferensiasi jaringan dan lain sebagainya.

III. Sistem Ubiquitin-Proteasome
Sistem ubiquitin-proteasome adalah sistem proteolitik utama yang mengontrol degradasi protein dan regulasi berbagai proses seluler, seperti perbaikan DNA, respons stres, dan proliferasi sel. UPS terdiri dari enzim spesifik yang memodifikasi substrat protein menggunakan ubiquitin, dan proteasome 26S yang bertanggung jawab atas proteolisis substrat tertanda-ubiquitin. Konjugasi ubiquitin ke substrat ini dilakukan oleh reaksi kaskade bertingkat yang terdiri dari enzim E1, E2, dan E3.Terdapat dua langkah utama pada jalur ini:

1. 1. perlekatan kovalen dari sinyal degradasi poliubiquitin terhadap substrat oleh enzim-enzim ubiquitinasi
   2. pengenalan spesifik rantai poliubiquitin dan pemecahan selanjutnya menjadi peptida dari protein yang ditargetkan oleh proteasome 26S

IV. Autofagi
Lisosom adalah komponen utama dari proses degradatif makromolekul pada sel mamalia. Kompartemen sel ini merupakan vesikel terbungkus membran dengan kandungan asam hidrolase konsentrasi tinggi yang menjadikan lumen bersifat asam (pH 4.5) dan densitas yang tinggi. Hidrolase lisosom terdiri dari protease, glikosidase, lipase, nuklease, dan fosfatase. Berbagai mekanisme autofagi penting untuk mentransportasikan substrat dari sitoplasma ke dalam lisosom. Transportasi substrat dan kapasitas hidrolitik lisosom merupakan penentu peran lisosom dalam proteolisis intraseluler secara keseluruhan.

V. Matrix Metalloproteinase
Atau yang dikenal sebagai MMP atau matrixin adalah anggota dari superfamili metzincin. Pada kondisi inflamasi, MMP dapat mendegradasi semua komponen ECM dan membran basal. Selain itu, MMP memiliki fungsi dalam meregulasi perakitan, struktur dan kuantitas ECM sehingga mampu meregulasi pelepasan atau aktivasi kemokin, sitokin, faktor pertumbuhan, peptida antibiotik, dan molekul bioaktif lainnya. Dengan demikian, MMP berpartisipasi dalam proses fisiologis seperti imunitas bawaan dan adaptif, peradangan, angiogenesis, remodeling tulang dan pertumbuhan neurit.

2. Metabolisme Asam Amino Pada Jaringan Tubuh

Berbagai asam amino (AA) atau disebut juga asam L-amino telah diidentifikasi bahkan dapat dibedakan berdasarkan rasa yang dihasilkan. Untuk kelompok AA esensial, kecuali treonin (Thr, manis) umumnya memiliki rasa pahit. Pengelompokkan rasa AA nonesensial biasanya memiliki manis atau umami. Kedua AA nonesensial seperti L-glutamat (Glu) dan L-aspartat (Asp) merupakan komponen AA paling besar yang dapat dijumpai pada protein makanan.

Makanan dengan rasa umami umumnya selain sebagai perasa, juga berfungsi sebagai biomarker yang bermanfaat dalam makanan untuk jaringan hewan dan/atau tumbuhan. Hewan dan manusia menggunakan informasi rasa umami yang ditransmisikan melalui cephalic relay untuk memulai proses pencernaan protein. Protein makanan akan dihidrolisis oleh protease dan peptidase menjadi peptida kecil dan AA bebas dengan gugus Glu dan Asp. Sebagian besar produk tersebut selanjutnya akan diambil oleh sel-sel mukosa intestinum (terutama enterosit) dan sebagian kecil oleh mikrobia di usus. Peptida kecil dan AA akan didegradasi oleh usus dan mikrobia dengan berbagai kecepatan. Dalam darah, AA diangkut dalam bentuk tidak terikat dan beberapa (misalnya, homosistein) dalam bentuk kompleks protein.

Perbedaan utama antara AA dan makronutrien lainnya yaitu AA mengandung nitrogen dan sulfur. Perbedaan pada rantai samping menjadikan masing-masing AA memiliki transporter sendiri dan jalur katabolik spesifik. Namun, katabolisme sebagian besar AA memiliki persamaan dalam menghasilkan piruvat, oksaloasetat, α-KG, fumarat, suksinil-KoA, dan asetil-KoA. Oksidasi sempurna AA membutuhkan kerja sama beberapa organ tubuh.

Berdasarkan tingkat konsumsi oksigen oleh hati menunjukkan AA yang sepenuhnya teroksidasi menjadi CO2 berjumlah sedikit atau tidak ada sama sekali. Metabolit AA seperti amonia, CO2, urea, asam urat, asetil-KoA, asam lemak rantai panjang dan rantai pendek, format, glukosa, H2S, badan keton, NO, poliamina, dan zat nitrogen lainnya, masing-masing memiliki fungsi biologis yang penting.

3. Pengenalan Pengujian Protein Dasar

a. Uji Protein Bradford
Uji protein Bradford adalah uji pengikatan dye berdasarkan perubahan warna diferensial dari dye sebagai respons terhadap berbagai konsentrasi protein. Pengujian ini direkomendasikan sebagai pengganti pengujian protein lainnya. Uji protein Bradford didasarkan pada pengamatan absorbansi maksimum untuk asam Coomassie Brilliant Blue G-250 bergeser dari 465 menjadi 595 nm ketika terjadi pengikatan dengan protein. Koefisien ekstingsi larutan kompleks dye-albumin adalah konstan pada rentang konsentrasi 10 kali lipat. Jadi hukum Beer dapat diterapkan untuk kuantisasi protein yang akurat dengan memilih rasio yang tepat dari volume dye terhadap konsentrasi sampel. Alasan penggunaan uji Bradford sebagai berikut:

• Uji protein Bradford sangat mudah digunakan yang hanya membutuhkan satu reagen dan 5 menit dibandingkan uji Lowry
• Absorbansi kompleks dye-protein relatif stabil, uji Bradford tidak memerlukan waktu kritis seperti Lowry
• Uji Bradford tidak terpengaruh oleh banyak senyawa yang membatasi Lowry

b. Pengujian Protein Biuret
Pengujian biuret adalah uji kolorimetri protein dan peptida pada sampel. Penandaan kompleks ungu dapat dihasilkan oleh garam tembaga dalam larutan basa dengan bahan yang mengandung dua ikatan peptida atau lebih. Absorbansi yang dihasilkan sebanding dengan jumlah ikatan peptida sehingga dapat menggambarkan jumlah molekul protein pada sampel. Dengan demikian, uji biuret cukup sesuai untuk penentuan protein total dengan spektrofotometri (pada 540-560 nm). Standarisasi metode biuret dengan albumin serum sapi atau manusia sudah lama digunakan.

c. Bicinchoninic Acid Assay (BCA)
Pengujian BCA berdasarkan pada reaksi garam natrium dari asam bicinchoninic dengan ion tembaga yang dihasilkan oleh reaksi biuret dalam kondisi basa. Kompleks tembaga asam bicinchoninic membentuk warna biru tua yang terbaca pada 562 nm. Reagen BCA cukup stabil dalam kondisi basa, sehingga dapat dimasukkan dalam larutan tembaga alkali biuret. Perkembangan warna dalam uji BCA bergantung pada faktor waktu, suhu dan pH. Pengujian ini juga kompatibel dengan deterjen, sehingga lebih baik daripada uji Lowry dan Coomassie.

Dibandingkan dengan Bradford, variabilitas protein/protein lebih sedikit pada uji BCA. Variabilitas tersebut juga dapat dikurangi apabila reaksi dilakukan pada 60°C reaksi. Selain itu, volume reagen juga dapat dikurangi dan pengujian juga dapat dilakukan pada 96-well plate. Namun, agen pereduksi ion tembaga, H2O2, fosfolipid dan agen pengkelat (misalnya, EDTA) mampu mengganggu keberhasilan pengujian BCA. Fosfolipid mengganggu uji protein BCA dengan menghasilkan nilai artifisial tinggi. Seperti metode Bradford, metode ini merusak protein sehingga downstream aplikasi protein setelahnya tidak dapat dilakukan.

d. Metode Bromcresol Green (BCG)
BCG merupakan pengujian yang paling umum dalam penentuan kadar albumin dan memiliki afinitas tinggi terhadap HSA. BCG memiliki dua bentuk, yaitu bentuk fenolik (pH 4-7) atau quinonoid (pH eksperimental 7,4) yang bergantung pada pH. Dalam bentuk quinonoid, bagian nonpolar terhubung ke gugus anionik yang memfasilitasi interaksi BCG dengan albumin melalui ikatan hidrogen, gaya hidrofobik dan elektrostatik sehingga menghasilkan afinitas tinggi. Dengan itu, BCG hingga saat ini masih menjadi probe spektrofotometri yang sesuai juga untuk pengujian albumin serum.

4. Assay Kit dalam Metabolisme Protein dan Asam Amino
Berikut kami persembahkan Assay kit dari Elabscience dalam pengujian protein dan asam amino pada sampel serum, plasma, jaringan, dan komponen biologis lainnya.
Tabel 1. Elabscience dengan Assay kit untuk pengujian metabolisme protein dan asam amino

Referensi:
1. Becker JM, Caldwell GA, Zachgo EA. 1996. Exercise 13 – Protein Assays. Biotechnology. 2nd Ed. Academic Press. pp. 119-124.
2. Bianchi-Bosisio A. 2005. Proteins – Physiological Samples. in P. Worsfold et al (Eds). Encyclopedia of Analytical Science. 2nd Ed. Elsevier. pp. 357-375.
3. Maruthamuthu M, Kishore S. 1988. Bromocresol green as a new spectrophotometric probe for serum albumins. Proceedings of the Indian Academy of Sciences, Chemical Sciences. 100(6): 525-533.
4. Shen C-H. 2019. Chapter 8 – Quantification and Analysis of Proteins. Diagnostic Molecular Biology. Academic Press. pp. 187-214.
5. Dardevet D. 2016. The Molecular Nutrition of Amino Acids and Proteins. Academic Press.
6. Wu G. 2021. Amino Acids: Biochemistry and Nutrition. CRC Press.

Artikel Terkait:
1. 6 Metode Deteksi Protein Yang Paling Umum Digunakan [link]
2. 3 Metode Deteksi Protein dari Merk Elabscience [link]
3. Isolasi dan Purifikasi Protein dengan Kit Komersial [link]
4. Assay Kit Deteksi Enzim Antioksidan pada Manusia [link]
5. Pengukuran Berbagai Marker Enzim dari Merk Elabscience [link]
6. 4 Marker Senyawa Yang Terlibat Siklus TCA (Tricarboxylic acid) [link]
7. Kit Metabolisme Lipid dari Merk Elabscience [link]