Bagaimana cara mendeteksi dan mendeteksi infeksi Mycoplasma pneumoniae penyebab wabah pneumonia komunitas dengan metode Real-Time PCR secara sederhana dan terstandar secara ilmiah.

A.  Bakteri Mycoplasma pneumoniae dan Marker Molekuler

Mycoplasma pneumoniae merupakan penyebab utama wabah pneumonia komunitas suatu daerah, baik pada anak-anak maupun orang dewasa. Wabah M. pneumoniae memiliki prevalensi tinggi dan sering terjadi di lingkungan tertutup seperti sekolah, penjara, rumah sakit dan lokasi jenis lainnya. Meskipun sebagian besar kasus bersifat ringan, namun 25% kasus dengan komplikasi ekstrapulmonal akibat keparahan pneumonia tersebut.

Pengujian PCR yang akan kami elaborasikan dalam penentuan infeksi M. pneumoniae merupakan metode probe berbasis hidrolisis (Taqman) dan primer spesifik M. pneumoniae. Dua marker M. pneumoniae (Mp3 dan Mp7) menargetkan gen ATPase, sedangkan marker Mp181 menargetkan gen toksin CARDS. Target RNaseP (RP) digunakan sebagai kontrol internal untuk memastikan kualitas templat, setup PCR dan eksekusi PCR berhasil dengan optimal. Dengan menggunakan keempat marker tersebut pada 96-well plate, 22 spesimen dapat diuji bersamaan dengan ‘no-template control’ (NTC) dan kontrol positif (PC).

Jika sampel banyak (high throughput), maka skrining awal untuk sampel perlu dilakukan. Marker Mp181 dan RP dapat digunakan untuk skrining, selanjutnya diikuti dengan pengujian ulang sampel positif dengan panel marker lengkap. Mp181 direkomendasikan sebagai marker utama untuk skrining karena sensitivitas lebih tinggi. Dengan demikian, prosedur ini akan meningkatkan tingkat deteksi dan memberikan metode mudah untuk melakukan tes cepat pada pasien yang diduga menderita infeksi M. pneumoniae.

B.  Metode

1. Reagen

– Primer/probe TaqMan (TM)

Primer disintesis secara optimal harus bersifat “sequencing grade” (Catatan 1). Pengenceran setiap primer disarankan pada 50 mM (diencerkan dalam air nuclease-free). Probe harus disintesis dengan label FAM 5’ dan label BHQ1 3’. Pengenceran probe direkomendasikan pada 10 mM (diencerkan diencerkan dalam air nuclease-free). Probe harus terlindung dari paparan cahaya. Pengenceran primer dan probe harus dijaga pada 4°C. Untuk penyimpanan jangka panjang, aliquot dapat dibekukan pada −20°C (Catatan 2).

Catatan:

1. Kemurnian primer sangat penting. Kami merekomendasikan untuk menggunakan produk “sequencing grade” karena kemurnian lebih tinggi. Primer dan probe dapat disintesis oleh produsen komersial (misalnya, Integrated DNA Technologies IDT dan manufaktur lainnya).
2. Siklus freeze–thaw berulang untuk primer/probe tidak direkomendasikan dikarenakan penurunan stabilitas. Pengenceran harus stabil hingga 6 bulan dan dapat diuji kontrol kualitas (menggunakan templat yang diketahui) setelah periode ini untuk memverifikasi kinerja probe. Stok untuk membuat pengenceran harus stabil pada 4°C untuk jangka waktu yang lebih lama (hingga satu tahun).

Tabel 1. Sekuens primer/probe PCR real-time M. pneumoniae

Probe perlu dikonjugasikan dengan label dengan 5’ FAM dan 3’ BHQ1. Probe Mp7-P di-quenching secara internal dengan BHQ1, diwakili oleh “(t).” “CARDS Tx” mengacu pada toksin wabah komunitas. RNaseP (RP) digunakan sebagai kontrol positif internal untuk mendeteksi keberadaan asam nukleat manusia.

• 2× Taqman PCR Master Mix (Solarbio: SR2110) digunakan sebagai master mix dan disimpan pada −20°C (Catatan 3)
• DNase/RNase-free water (Solarbio: R1600) dan disimpan pada suhu ruangan. Botol atau tube terpisah direkomendasikan untuk penggunaan Master Mix dan pengenceran stok primer/probe.

Catatan:

3. 2× MasterMix tidak perlu diencerkan karena proporsi Master Mix dengan reagen lain membuat campuran menjadi 1× pada konsentrasi akhir. Jika pengenceran hingga 1× dilakukan, maka penambahan primer dan DNA akan membuat konsentrasi campuran menjadi kurang dari 1×. Apabila melakukan reaksi PCR tidak terlalu sering atau dalam jumlah kecil, direkomendasikan untuk meng-aliquot Master Mix menjadi volume-volume kecil sebelum membekukannya karena siklus freeze-thaw berulang akan mengurangi efisiensi reagen.

2. Bahan dan Consumables

1. Platform plastik dapat dengan PCR 96-well plate, atau PCR Tubes 0.2ml DNase/RNase-free (Jet-Biofil:  PCR000200) atau PCR 8-cap strips (Jet-Biofil: PCR100200)
2. Microcentrifuge tube DNase/RNase-free 1.5 mL (Jet-Biofil: CFT011015 & CFT001015)
3. Microtips dengan filter/aerosol-barrier (Jet-Biofil: PPT101010,  PPT151200, PPT101000)
4. Micropipette single channel adjustable: 0.5-10μl (Bio-DL: 72441031), 10-100μl (Bio-DL: 72441061), 20-200μl (Bio-DL: 72441071), 100-1000μl (Bio-DL: 72441081)
5. Gaun dan sarung tangan sekali pakai.
6. Desinfektan seperti Surface RNase Erasol (Solarbio: 7005) untuk membersihkan permukaan dan menonaktifkan kontaminasi RNase serta memastikan lingkungan kerja RNA yang optimal dan bersih.

3. Alat Instrumentasi

1. Pilihan instrumen dapat berupa: ABI PRISM Real-Time PCR System (Conquer Scientific), eQ9600 Real-time PCR System 96-Well Format (Eastwin), Q3200 Real-Time PCR System (Bio-Gener: 2 channel atau 4 Channel) atau lainnya

4. Prosedur Tiga Ruang

Langkah-langkah berikut diuraikan untuk menjelaskan setup (susunan), eksekusi dan analisis real-time PCR M. pneumoniae.

a. Prosedur ‘Ruang Bersih’

1. PCR Master Mix harus dipreparasi pada ‘Ruang Bersih’ dan sejauh mungkin dari area berpotensi menimbulkan kontaminasi asam nukleat. Gaun dan sarung tangan harus dikenakan dan semua permukaan serta setiap pipet harus dibersihkan dengan Surface RNase Erasol (Solarbio: 7005). Master Mix harus digunakan segera setelah preparasi dan tidak disimpan lebih dari 1 jam pada 4°C setelah diformulasi. Penyimpanan lebih lama setelah formulasi dapat menghasilkan kinerja lebih rendah termasuk hasil positif/negatif palsu.
2. Master Mix mengandung reagen per reaksi, sebagai berikut:

Tabel 1. Komponen dan sistem Master Mixing

ROX Reference Dye digunakan untuk memperbaiki eror sinyal fluoresensi antara sumur amplifier PCR Real Time beberapa produsen.

• ROX Reference Dye I (50×) sesuai untuk ABI PRISM 7000/7700/7300/7900HT, StepOnePlus Real-Time PCR System dan lainnya
• ROX Reference Dye II (100×) sesuai untuk 7500 Real-Time PCR System, 7500 Fast Real-Time PCR System, Stratagene Mx3000P, Mx3005P, Mx4000.

Konsentrasi reaksi akhir ROX Reference Dye I dan II adalah 1×. Platform amplifikasi PCR Real Time seperti LightCycler, Thermal Cycler Dice Real-Time System II, Smart Cycler System, dan sejenisnya tidak perlu menggunakan ROX Reference Dye.

1. Setup well-plate dan dispensing master mix sangat penting untuk meminimalkan potensi kontaminasi. Untuk hasil optimal, master mix harus ditambahkan dalam baris sedangkan sampel ditambahkan dalam kolom.

Tabel 2. Setting posisi well plate.

Untuk 96-well plate, Master Mix primer/probe masing-masing ditambahkan dalam baris (A–H). Untuk penggunaan semua marker, Mp181 (baris A dan E), Mp3 (baris B dan F), Mp7 (baris C dan G), dan RP (baris D dan H) ditampilkan pada tabel diatas. Sampel diposisikan pada sumuran di atas (S1– S22). NTC (A1–D1) ditambahkan terlebih dahulu, diikuti oleh setiap sampel, dan terakhir yaitu kontrol positif (PC, E9–H12).

Gambar 1. PCR well-plate dan Master Mix

1. Sebelum di-dispensing ke well-plate, Master Mix harus dicampur dengan micropipette secara perlahan 5–10 kali. Dispensi 25 μl Master Mix ke sumuran (atau tube) yang digunakan.
2. Tambahkan 5 μl nuclease-free water ke dalam sumuran “NTC”; tutup semua sumur NTC di ruang bersih sebelum dipindahkan ke ‘Ruang Templat’ (Catatan 4).

Catatan:

4. Setup well-plate diatas menunjukkan pemisahan sejauh mungkin antara NTC dari sumur Kontrol Positif (PC) harus menjadi praktik standar untuk memastikan kualitas setup dan eksekusi assay. NTC harus ditambahkan di ‘Ruangan Bersih’ dan ditutup pada ruangan tersebut. PC harus ditambahkan terakhir pada well-plate, setelah semua sampel ditambahkan dan ditutup. PC dapat berupa sampel klinis positif M. pneumoniae atau dapat menggunakan asam nukleat yang diekstraksi dari kultur M. pneumoniae dan ditambah dengan asam nukleat manusia yang tersedia secara komersial (atau diisolasi di laboratorium) untuk memastikan reaksi RNaseP positif.

b. Prosedur ‘Ruang Templat’

1. Pindahkan well-plate ke ‘Ruang Templat’ (Catatan 4).
2. Asam nukleat yang diekstraksi harus diletakkan di atas balok es selama prosedur ini dan ditambahkan ke well-plate di Biological Safety Cabinet (Being: BBC-3S1, BBC-4S1, BBC-5S1, BBC-6S1) atau kabinet isolasi (Catatan 5).
3. Tambahkan 5 μl asam nukleat yang diekstraksi dari sampel untuk sistem 25 μl ke sumuran. Sarung tangan harus diganti jika terkontaminasi oleh sampel atau rusak (Catatan 6).
4. Lid/cap empat sumuran sampel harus dipasang pada setiap kolom sumuran jenis sampel sama sebelum melanjutkan ke kelompok sumuran sampel berikutnya.
5. Setelah semua sampel ditambahkan dan ditutup, kontrol positif (PC) M. pneumoniae dengan nilai Ct antara 25 – 30 harus ditambahkan dan ditutup.
6. Well-plate harus disentrifugasi selama 1 menit pada 500 – 750 ×g untuk memastikan bahwa semua reagen dan templat berada di dasar setiap sumuran.
7. Sebelum meninggalkan ‘Ruangan Templat’, semua tutup harus diperiksa untuk memastikan bahwa Lid/cap sudah rata dengan well-plate. Periksa sumuran dengan hati-hati untuk memastikan tidak ada gelembung udara. Lakukan sentrifugasi perlu dilakukan kembali apabila ada gelembung.
8. Gaun dan sarung tangan harus dibuang sebelum keluar dari ruang templat dan kemudian diautoklaf untuk mencegah wabah. Gaun tidak boleh digunakan kembali.
9. Pindahkan well-plate PCR yang telah disiapkan ke ‘Ruang Instrumen PCR’.

c. Prosedur ‘Ruang Instrumen PCR’

1. ABI 7500 (atau instrumen setara dengan channel FAM) harus diprogram menggunakan kondisi siklus di bawah ini dan running dalam mode “standard” dengan kondisi volume reaksi 25 μl, sebagai berikut:

95 ºC 2 menit, diikuti 45 siklus 95 ºC 10 detik, dan 60 ºC 30 detik

(akuisisi data untuk FAM)

1. Reference dye pasif (jika menggunakan ABI 7500) harus disetel ke “none.”
2. Untuk instrumen, setelah pengoperasian selesai (~1,5 jam), pilih “Analyze” untuk menetapkan threshold value (garis threshold akan berubah dari merah menjadi hijau).
3. Default menampilkan data dalam format logaritmik, namun lebih mudah apabila divisualisasikan format linier. Untuk mengubah format logaritmik ke linier, klik dua kali pada sumbu-y, centang kotak yang menunjukkan tampilan linier pada blok “post-run settings”, klik “apply”, dan lihat data dalam format kurva sigmoid.
4. Sesuaikan threshold value sehingga garis melintasi kurva di awal fase eksponensial. Semua kontrol harus dianalisis terlebih dahulu untuk memvalidasi eksperimen. Kurva pertumbuhan amplifikasi yang menunjukkan peningkatan eksponensial dan melewati threshold dianggap sebagai hasil PCR “positif” untuk marker tersebut. Hasil tidak memiliki kurva pertumbuhan eksponensial dalam 45 siklus dianggap sebagai hasil “negatif” untuk sampel marker tersebut
5. Hasil laporan dapat dibuat dengan menggunakan software yang dapat diprogram untuk sesuai kebutuhan, termasuk nomor sumuran, informasi sampel, data threshold dan nilai Ct.

Gambar 2. Well-plate diletakkan pada Platform Real-Time PCR.

Catatan:

5. Gaun dan sarung tangan yang digunakan di ‘Ruang Bersih’ dapat digunakan di ‘Ruangan Templat’ untuk menghindari pelepasan-pemakaian berulang selama proses ini, namun tidak boleh sebaliknya. Permukaan kerja, pipet dan peralatan lainnya harus didekontaminasi dengan larutan Surface RNase Erasol sebelum melanjutkan penambahan templat. Setelah templat ditambahkan ke well-plate, semua sarung tangan dan gaun harus dibuang dan diautoklaf untuk menghindari kontaminasi serta pipet dan permukaan kerja harus didekontaminasi lagi dengan Surface RNase Erasol. Sinar UV dapat digunakan untuk membantu dekontaminasi.
6. DNA yang dipreparasi dari Qiagen, Solarbio, ABPBio, Qiagen, Invitrogen atau kit komersial lainnya dapat digunakan. DNA harus diuji segera untuk memastikan hasil yang optimal.
7. Gunakan 5 μl sampel untuk memastikan pemipetan dan penambahan sampel akurat. Jika volume sampel terbatas, kurang dari 5 μl sampel dapat ditambahkan dan volume nuclease-free water harus disesuaikan hingga total 25 μl.
8. Sampel harus diambil dari pasien fase awal infeksi atau saat pertama kali gejala infeksi saluran pernafasan muncul. Sampel meliputi swab orofaring dan/atau nasofaring, diangkut dan disimpan dalam ~2 ml viral UTM® Universal Transport Medium™ (COPAN: 3C057N, 3C058N). Sampel yang diangkut dalam waktu 72 jam dapat dikirim pada 4°C. Jika lebih dari 72 jam, sampel harus disimpan antara suhu −20 dan −70ºC dan dikirim menggunakan dry ice. Sampel BAL (bronchoalveolar lavage) dapat diterima.
9. Sampel positif harus menunjukkan kurva eksponensial ketika melewati threshold value. Bergantung pada faktor-faktor, nilai Ct dapat bervariasi secara dramatis (dari ~20 hingga 40 atau lebih besar). Nilai Ct positif akhir harusnya menunjukkan isolasi kultur. Sampel yang menghasilkan kurva akhir (nilai Ct 40–45) atau menampilkan kurva yang tidak eksponensial harus diuji ulang lagi dengan qPCR atau metode tradisional lainnya.
10. Karena marker spesifik berbeda (misalnya, Mp181, Mp3, Mp7) dapat digunakan pada sampel yang sama, masing-masing marker tersebut mungkin mengandung tingkat fluoresen latar belakang berbeda dan memerlukan analisis terpisah agar dapat menilai status sampel dengan tepat. Ketiga marker tersebut juga dapat berfungsi untuk meningkatkan skill interpretasi hasil.
11. Nilai RNaseP dapat membantu dalam menilai kualitas asam nukleat yang diekstraksi. Kurva amplifikasi yang tidak ada atau buruk (contohnya, tidak eksponensial) menunjukkan templat memiliki kualitas buruk dan sampel harus diekstraksi kembali. Kurangnya amplifikasi pada sampel manapun termasuk PC dapat mengindikasikan preparasi Master Mix yang kurang optimal.
12. Karena marker RNaseP mendeteksi DNA manusia, maka kontaminasi pada stok dan bahan habis pakai PCR sangat mudah terjadi jika prosedur PCR tidak diikuti secara benar. Jika stok terkontaminasi, maka harus dibuang dan dipesan kembali. Beberapa kasus, personil dapat mengamati kurva “positif” pada RNaseP NTC. Hal ini harus diinterpretasikan dengan hati-hati dan menunjukkan bahwa kontaminasi telah terjadi di dalam laboratorium. Hal-hal positif ini mengindikasikan sensitivitas prosedur dan perlunya dekontaminasi rutin pada permukaan dan peralatan.
13. Jika analisis campuran reaksi pasca PCR diperlukan tetapi tidak dapat dilakukan segera, well-plate harus disimpan pada suhu −20ºC untuk memastikan stabilitas amplikon DNA.

C.  Referensi

1. Domingues L. 2023. PCR: Methods and Protocols. 2nd Ed. Humana. Springer.
2. Domingues L. 2017. PCR: Methods and Protocols. 1st Ed. Humana. Springer.
3. Bartlett JMS, Stirling D. 2003. PCR Protocols. Humana. Springer.
4. Biassoni R, Raso A. 2020. Quantitative Real-Time PCR: Methods and Protocols. Humana. Springer.
5. Wilks M. 2013. PCR Detection of Microbial Pathogens. Humana. Springer.

D.  Artikel Terkait

1. Deteksi Infeksi Patogen dalam Transplantasi Organ dan Jaringan dengan Liferiver Real-Time PCR Kit
2. Skrining Kanker Menggunakan Kit Real-Time PCR Onkologi Generi Biotech
3. Diagnosis Mutasi Trombofilia Menggunakan Kit Real-time Pcr Dari Generi-biotech
4. Deteksi Penyakit Pada Tanaman Dengan PCR Kit Merk Loewe Germany
5. PCR Kit IVD untuk deteksi SARS-CoV-2
6. Deteksi Adulterant dan Kontaminan Pada Pangan Dengan Metode ELISA, PCR dan Rapid Test
7. Real Time PCR, Level Baru Amplifikasi DNA
8. Tahukah Anda tentang Conventional PCR / PCR Konvensional
9. Mengenal Plasmid dalam Penelitian Genetik