Fitokimia Bagian 2: Ekstraksi, Isolasi dan Identifikasi Senyawa Bioaktif Ekstrak Tanaman

Published by Administrator at August 19, 2019

Bagian 2 (dari 2 bagian)

2.4. Tehnik Isolasi dan Purifikasi Molekul Bioaktif dari Tanaman

Isolasi dan Purifikasi senyawa bioaktif dari tanaman telah berkembang pesat beberapa tahun belakangan ini. Tehnik modern menawarkan kemampuan pengembangan yang paralel dan ketersediaan bioassay yang canggih di satu sisi dan menyediakan tehnik isolasi, separasi dan purifikasi yang presisi di sisi yang lain. Tujuan ketika mencari senyawa bioaktif adalah menemukan metode yang tepat yang dapat menapis sumber bioaktifitas seperti antioxidant, antibakteri atau sitotoksisitas yang dikombinasikan dengan simplisitas, spesifitas dan kecepatan pengerjaan.

Baca juga artikel Fitokimia Bagian 1 : Ekstraksi, Isolasi dan Identifikasi Senyawa Bioaktif Ekstrak Tanaman di sini

Metode in vitro biasanya lebih dipilih dibanding in vivo karena eksperimen dengan hewan coba mahal, menyita waktu dan sering menimbulkan kontroversi etik. Ada beberapa faktor yang membuat mustahil menemukan prosedur atau protokol yang final untuk mengisolasi dan karakterisasi molekul bioaktif tertentu. Ini bisa terjadi karena perbedaan bagian (jaringan) tanaman, banyak diantaranya memproduksi senyawa yang berbeda, belum lagi perbedaan dalam struktur kimia dan sifat fisikokimianya.

Tahapan seleksi dan koleksi bagian tanaman sangat penting dalam mengisolasi dan karakterisasi fitokimia senyawa bioaktif. Tahap berikutnya melibatkan penelusuran informasi etnobotani untuk memisahkan kemungkinan molekul bioaktif. Ekstrak kemudian dapat dibuat dengan berbagai macam pelarut untuk mengisolasi dan mempurifikasi senyawa aktif yang bertanggung jawab pada bioaktifitas. Tehnik Kromatografi Kolom dapat digunakan untuk isolasi dan purifikasi senyawa bioaktif. Instrumen lain yang telah dikembangkan misalnya saja High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) dapat mempercepat proses purifikasi molekul bioaktif. Beberapa tehnik spektroskopi yang berbeda seperti UV-visible, Infrared (IR), Nuclear Magnetic Resonance (NMR), dan spektroskopi massa dapat mengidentifikasi dan mempurifikasi senyawa.

2.5. Purifikasi Molekul Bioaktif

Banyak molekul bioaktif telah diisolasi dan dipurifikasi dengan menggunakan metode paper thin-layer/TLC dan kromatografi kolom. Kromatografi kolom dan thin-layer chromatography (TLC) paling banyak digunakan karena mudah, ekonomis dan tersedia dalam berbagai fase stasioner. Silika, alumina, cellulose dan polyamide menunjukkan nilai paling baik dalam memisahkan fitokimia. Bagian tanaman yang memiliki senyawa fitokimia yang kompleks, membuat separasi dengan hasil bagus menjadi sulit. Karenanya, menambah polaritas dengan menggunakan beberapa fase bergerak berguna untuk menghasilkan separasi yang baik. Thin-layer chromatography (TLC) selalu digunakan selalu digunakan untuk menganalisis fraksi senyawa dengan kromatografi kolom.

2.6. Klarifikasi Struktur Molekul Bioaktif

Penentuan struktur molekul tertentu dengan menggunakan berbagai tehnik spektroskopi seperti as UV-visible, Infrared (IR), Nuclear Magnetic Resonance (NMR), dan spectroskopi massa. Prinsip dasar dari spektroskopi adalah melewatkan radiasi elektromagnetik melalui molekul organik yang menyerap sebagian radiasi, tapi tidak semua. Dengan mengukur jumlah penyerapan radiasi elektromagnetik, sebuah spektrum akan dihasilkan. Spektrum khusus untuk ikatan tertentu dalam sebuah molekul. Berdasarkan spektrum ini struktur molekul organik dapat diidentifikasi. Para ilmuwan menggunakan spektrum yang berasal dari tiga atau 4 area yaitu – Ultraviolet (UV), Visible, Infrared (IR), frekuensi radio dan berkas elektron – untuk klarifikasi struktur.

2.7. Spektroskopi UV-Visible

Spektroskopi UV-visible dapat dilakukan untuk analisis kualitatif dan untuk identifikasi senyawa dari kelas tertentu dalam keadaan murni atau campuran. Lebih disukai, Spektroskopi UV-visible dapat digunakan untuk analisis kuantitatif karena molekul aromatik merupakan kromofor yang kuat pada kisaran UV.

Senyawa alami bisa ditentukan dengan menggunakan spektroskopi UV-visible. Senyawa fenolik seperti antosianin, tanin, pewarna polimer dan fenol bentuk kompleks dengan besi bisa dideteksi dengan spektroskopi ultraviolet/visible (UV-Vis). Selain itu, tehnik Spektroskopi UV-vis kurang selektif dan memberikan informasi komposisi total kandungan polifenol. Spektroskopi UV-visible telah digunakan untuk menentukan total ekstrak fenolik (280 nm), flavon ( 320 nm), asam fenolik (360 nm) dan total antosianid (520 nm). Tehnik ini tidak menyita waktu dan lebih hemat dibanding tehnik lainnya.

2.8. Spektroskopi Infrared

Beberapa frekuensi akan diserap ketika cahaya infrared dilewatkan pada sampel senyawa organik; namun, beberapa frekuensi akan ditransmisikan melalui sampel tanpa terjadi penyerapan. Penyerapan infrared berkaitan dengan perubahan getaran/vibrasional yang terjadi di dalam molekul terpapar radiasi infrared. Karenanya spektroskopi Infrared dapat digambarkan sebagai spektroskopi vibrasional/getaran.

Ikatan yang berbeda (C–C, C=C, C≡C, C–O, C=O, O–H, and N–H) memiliki frekuensi getaran yang berbeda pula. Jika jenis ikatan ini ada dalam molekul organik, mereka dapat diidentifikasi dengan mendeteksi karakteristik frekuensi penyerapan ikatan dalam spektrum infrared. Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) merupakan perangkat analitik resolusi tinggi untuk mengidentifikasi konstituen kimia dan menguraikan struktur senyawa. FTIR menawarkan investigasi yang cepat dan non-destruktif dari ekstrak herbal atau serbuk.

2.9. Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR)

NMR terutama terkait dengan sifat magnetik inti atom tertentu; terutama inti atom hidrogen, proton, karbon dan isotop karbon. Spektroskopi NMR telah membuat peneliti mampu mempelajari molekul dengan merekam perbedaan antara inti magnet yang berbeda dan karenanya mendapat gambaran yang jelas mengenai posisi inti tersebut dalam molekul. Juga, hal ini akan menunjukkan keberadaan atom di grup sebelahnya. Sebenarnya, dapat juga menyimpulkan seberapa banyak jumlah atom yang ada di lingkungan tersebut.

2.10. Spektrometri Massa untuk Identifikasi Senyawa Kimia

Dalam spektrometri massa, molekul sampel dalam fase uap dibombardir dengan elektron berenergi tinggi (70 eV) yang menyebabkan lepasnya satu elektron dari kulit valensi molekul tersebut. Dengan menggunakan spektrometri massa, massa molekul relatif (berat molekul) dapat ditentukan dengan akurasi tinggi dan formula molekul yang tepat dapat ditentukan dengan mengetahui lokasi di mana molekul telah terfragmentasi.