Kit Stress Oksidatif dari Cayman Chemical Bag. 3 – Kerusakan DNA dan RNA

Sebelum membaca bagian 3, sebaiknya Anda baca terlebih dahulu dari bagian 1 : peroksidasi lipid di sini

Kerusakan DNA

Radikal bebas dan spesies reaktif secara terus menerus dihasilkan secara in vivo dan menyebabkan terjadinya kerusakan oksidatif pada biomolekul. Tubuh manusia sebagai sebuah sistem memberikan perlindungan dengan beraneka ragam antioksidan dan sistem perbaikan yang mengganti asam nukleat, lipid dan protein yang mengalami kerusakan. DNA merupakan target serangan utama oleh serangan oksidatif.

Kerusakan DNA yang dipicu secara oksidatif biasanya berhubungan dengan ROS adalah situs DNA apurinic/apyrimidinic (AP), yaitu purin dan pirimidin teroksidasi, pecahan DNA untai ganda dan untai tunggal. Beberapa penelitian mengungkapkan peran stress oksidatif dan kerusakan DNA pada penyakit manusia dan mengusulkan beberapa kerusakan DNA secara oksidatif seperti 8-oxo-7,8-dihydro-2′-deoxyguanine (8-oxodG), also known as 8-hydroxydG (8-OHdG) , thymine glycol, situs AP dan lesi kelompok DNA yang dihasilkan secara oksidatif (OCDL; oxidatively generated clustered DNA lesion) sebagai biomarker baru stress oksidatif.

Guanine adalah basa yang paling rentan terhadap oksidasi ketika DNA dan RNA mengalami kerusakan. Proses perbaikan yang dimulai untuk memperbaiki kerusakan ini melepaskan beberapa spesies guanin teroksidasi ke dalam urin. Spesies ini termasuk basa bebas ribosa (8-hydroxyguanine), nukleosida dari RNA (8-hydroxyguanosine), dan deoxynucleoside dari DNA (8-hydroxy-2′-deoxyguanosine). 8-Hydroxyguanosine dilaporkan menjadi marker yang lebih baik dari kerusakan oksidan terkait usia dan 8-hydroxyguanine adalah marker yang lebih baik pada pasien kanker tertentu.

Telah diterima oleh komunitas peneliti bahwa kerusakan oksidatif yang kontinyu terhadap DNA merupakan kontributor utama untuk perkembangan kanker terkait-usia seperti kanker kolon atau kanker usus, kanker payudara, kanker rektum dan kanker prostate. Di antara banyak jenis kerusakan DNA oksidatif, pembentukan 8-hydroxy deoxyguanosine (8-OHdG) adalah marker atau penanda stres oksidatif yang banyak ditemukan. 8-OHdG, salah satu produk samping kerusakan oksidatif, secara fisiologis dibentuk dan dipicu oleh bahan kimia karsinogenik. Selama perbaikan DNA yang rusak secara in vivo oleh enzim eksonuklease, 8-OHdG yang dihasilkan diekskresikan tanpa metabolisme lebih lanjut ke dalam cairan urin.

Kerusakan RNA

Secara historis, 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine adalah biomarker yang paling diterima sebagai penanda kerusakan oksidatif pada DNA, namun dalam beberapa tahun terakhir semakin dipahami bahwa penanda kerusakan RNA juga harus diperiksa. Kerusakan RNA telah diteliti berhubungan dengan banyak penyakit syaraf misalnya penyakit alzheimer, penyakit Parkinson dan Demensia dengan Lewy Bodies (Gambar 1). Nunomura et al., 1999 dalam Wurtmann dan Wolin 2009, menyatakan bahwa pada penyakit Alzheimer, tingginya level 8-oxoG RNA pada sitoplasma dan nukleoli sel saraf telah diteliti dengan immunostaining pada sayatan otak post-mortem yang di treatment dengan DNAse dari pasien dengan Alzheimer dan dibandingkan dengan pasien kontrol.

Terdapat kenaikan ketertarikan para ilmuwan dalam meneliti urinary 8-oxodG untuk mengetahui peran stress oksidatif pada penyakit dan melakukan evaluasi untuk strategi intervensi. Baik pada penyakit ganas atau penyakit neurodegeneratif, 8-oxodG dideteksi pada jaringan dan cairan tubuh seperti serum, plasma, cerebrospinal fluid dan urine karena lesi ini ada pada level tinggi dalam DNA genomik dan DNA mitokondria. Pembentukan 8-oxodG dapat dideteksi pada DNA sel dan cairan tubuh dengan dua pendekatan yaitu antibodi spesifik dan metode kromatografi.

Gambar 1. Peran kerusakan oksidatif RNA terhadap berbagai penyakit degeneratif kronis (gambar diedit dari Fimognari, 2015)

Cayman Assay Kit

Cayman telah mengembangkan assay kit yang cepat dan terpercaya untuk mendeteksi berbagai jenis kerusakan DNA dan RNA. Misalnya saja DNA/RNA Oxidative Damage (High Sensitivity) ELISA Kit no katalog 589320. ELISA kit ini mendeteksi ketiga spesies guanin teroksidasi; 8-hydroxy-2-deoxyguanosine dari DNA, 8-hydroxyguanosine dari RNA, dan 8-hydroxyguanine dari DNA atau RNA. Beberapa vendor komersial (misalnya Cell Biolabs) menawarkan immunoassay yang hanya mendeteksi 8-hydroxy-2-deoxyguanosine saja, dan tidak untuk dua molekul lainnya. Keuntungan dari kit Cayman adalah kit ini bisa mendeteksi serangkaian produk yang lebih lengkap secara biologis dari kerusakan oksidatif daripada pengujian yang dibatasi hanya untuk analisis 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine saja.

Component kit dari DNA/RNA Oxidative Damage (High Sensitivity) ELISA Kit no katalog 589320 sebagai berikut:

• DNA/RNA Oxidative Damage ELISA Monoclonal Antibody
• DNA/RNA Oxidative Damage AChE
• Tracer
• DNA/RNA Oxidative Damage ELISA Standard
• ELISA Buffer Concentrate (10X)
• Wash Buffer Concentrate (400X)
• Polysorbate 20
• Goat Anti-Mouse IgG Coated Plate
• 96-Well Cover Sheet
• Ellman’s Reagent
• ELISA Tracer Dye
• ELISA Antiserum Dye

Ada beberapa alat, perlengkapan dan bahan yang harus disiapkan oleh para peneliti untuk pengukuran 8-OHdG, diantaranya yaitu:

• Microplate reader
• Mikropipet
• UltraPure water, Cayman no katalog 400000
• Bahan yang digunakan untuk preparasi sample

Untuk lebih rinci mengenai spesifikasi dan protocol atau manualnya dapat ditemukan pada link pdf ini. Metode kit 8-OHdG ini adalah competitive ELISA. Cayman sebagai salah satu manufacture ELISA dan reagent terpercaya, melakukan quality control yang ketat sebelum mengirimkan kit ELISA ke pelanggan. Selain untuk human, tersedia juga assay kit lainnya yang spesifik untuk spesies mouse dan rat. Indogen sebagai distributor Cayman di Indonesia, memastikan kit yang dijual memiliki expiration date yang cukup panjang.

Alternatif

Selain dari merk Cayman, OxiSelect™ Oxidative DNA Damage ELISA Kit (8-OHdG Quantitation) dari Cell Biolabs bisa dijadikan alternatif. Kit 8-OHdG adalah enzyme immunoassay (EIA) competitive yang dikembangkan untuk deteksi cepat dan kuantisasi 8-OHdG dalam urine, serum, sel atau sample jaringan. Sensitivitas kit ELISA 8-OHdG berkisar antara 100 pg/ml hingga 20 ng/ml. Jumlah 8-OHdG pada sample yang belum diketahui ditentukan dengan membandingkan absorbansinya dengan kurva standar 8-OHdG yang telah diketahui. Tiap kit menyediakan component reagen untuk melakukan assay sebanyak 96 well.

Sumber:

1. Thanan et al. 2015. Oxidative Stress and Its Significant Roles in Neurodegenerative Diseases and Cancer. Int J Mol Sci.
2. Wurtmann dan Wolin. 2009. RNA under attack: Cellular handling of RNA damage. Crit Rev Biochem Mol Biol.
3. Yan dan Zaher. 2019. How do cells cope with RNA damage and its consequences? J Biol Chem.
4. Fimognari C. 2015. Role of Oxidative RNA Damage in Chronic-Degenerative Diseases. Versi online: https://doi.org/10.1155/2015/358713.
5. Web vendor: caymanchem.com, abcam.com, cellbiolabs.com