Oxidative stress atau dikenal dengan stres Oksidatif merupakan salah satu kejadian dimana radikal bebas (Oxygen Reactive Species/ROS) dalam tubuh melebihi kapasitas tubuh untuk menetralkannya. Reactive Oxygen Species (ROS) seperti superoxide dan hydrogen peroxide terus menerus diproduksi selama proses metabolisme. Pembentukan ROS biasanya diimbangi oleh aksi enzim antioksidan dan molekul redoks lainnya. Namun, ROS yang berlebihan dapat menyebabkan kerusakan seluler dalam bentuk DNA, lipid, dan protein yang rusak. Spesies oksigen reaktif yang berlebihan harus segera dihilangkan dari sel oleh berbagai mekanisme pertahanan antioksidan. Enzim antioksidan seluler dan molekul redoks lainnya berfungsi untuk mengimbangi ROS yang dihasilkan dalam sel. ROS dapat diukur secara langsung melalui pengikatan ke pewarna fluoresen. Saat ini telah tersedia dua pengujian untuk mendeteksi ROS secara universal dalam berbagai jenis sampel.

1. Pengujian Reactive Oxygen Species (ROS) Intraseluler

Radikal bebas dan spesies reaktif lainnya terus-menerus dihasilkan secara in vivo dan menyebabkan kerusakan oksidatif pada biomolekul, suatu proses yang dikendalikan oleh keberadaan beberapa sistem antioksidan dan perbaikan serta penggantian asam nukleat, protein, dan lipid yang rusak. Mengukur efek terapi antioksidan dan aktivitas ROS secara intraseluler sangat penting untuk menekan atau mengobati pemicu stres oksidatif.

Gambar 1. OxiSelect™ Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence)

Pengujian ROS Intraseluler telah disediakan oleh Cell Biolabs untuk jenis sampel kultur sel. Kit yang ditawarkan adalah OxiSelect™ Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence) Cat.#STA-342, kit ini berbasis sel untuk mengukur aktivitas hidroksil, peroksil, dan spesies oksigen reaktif lainnya di dalam sel. Pengujian ini menggunakan probe fluorogenik permeabel sel DCFH-DA, yang berdifusi ke dalam sel dan deasetilasi oleh esterase seluler menjadi DCFH non-fluoresensi, kemudian dengan cepat dioksidasi menjadi 2’, 7’-Dichlorodihydrofluorescein (DCF) yang sangat berfluoresensi oleh ROS (Gambar 2).

Gambar 2. Proses pewarnaan Floresensi Kit ROS Assay Cell Biolabs

Prinsip Kerja Kit

Sel dikultur dalam pelat kultur sel 96 well dan kemudian diinkubasi terlebih dahulu dengan DCFH-DA, yang bersifat permeabel terhadap sel. Sampel antioksidan atau ROS yang tidak diketahui kemudian ditambahkan ke dalam sel. Setelah inkubasi singkat, kemudian dilakukan pembacaan pada fluorescence plate reader. Kandungan ROS atau antioksidan dalam sampel ditentukan dengan membandingkannya dengan kurva standar DCF yang telah ditentukan sebelumnya.

2. Pengujian Reactive Oxygen Species (ROS) / RNS In Vitro

Pengujian ROS/RNS In Vitro telah disediakan oleh Cell Biolabs untuk jenis sampel plasma, serum, urin, lisat sel, atau supernatan kultur sel. OxiSelect™ In Vitro ROS/RNS Assay Kit (Green Fluorescence) Cat.#STA-347 menyediakan metode yang sensitif untuk mendeteksi total reactive oxygen species (ROS) ditambah reactive nitrogen species (RNS) dalam berbagai jenis sampel. Pengujian ini menggunakan probe quenched fluorogenik yaitu dichlorodihydrofluorescin DiOxyQ (DCFH-DiOxyQ), yang merupakan probe ROS/RNS spesifik yang berdasar pada senyawa kimia populer yang mirip dengan diasetat 2’, 7’-dichlorodihydrofluorescein. Probe DCFH-DiOxyQ pertama-tama disiapkan dengan reagen penghilang quench, dan selanjutnya distabilkan dalam bentuk DCFH yang sangat reaktif. Dalam keadaan reaktif ini, spesies ROS dan RNS dapat bereaksi dengan DCFH, yang dengan cepat teroksidasi menjadi 2’, 7’-dichlorodihydrofluorescein (DCF) yang sangat fluoresensi (Gambar 3).

Gambar 3. Proses Fluorosensi Kit Assay ROS plus RNS In Vitro Cell Biolabs

Intensitas fluoresensi sebanding dengan total kadar ROS/RNS dalam sampel. Probe DCFH-DiOxyQ dapat bereaksi dengan hidrogen peroksida (H2O2), radikal peroksil (ROO·), oksida nitrat (NO), dan anion peroxynitrite (ONOO-). Molekul radikal bebas ini merupakan representasi dari ROS dan RNS, sehingga memungkinkan pengukuran total populasi radikal bebas dalam sampel. Kit Uji ROS/RNS In Vitro OxiSelect™ juga dapat digunakan untuk mengevaluasi efek antioksidan pada radikal bebas. Kit ini memiliki batas sensitivitas deteksi sebesar 10 pM untuk DCF dan 40 nM untuk H2O2.

Prinsip Kerja Kit

Kit Uji ROS/RNS In Vitro OxiSelect™ merupakan uji in vitro untuk mengukur aktivitas radikal bebas ROS/RNS total. Sampel atau standar ROS atau RNS ditambahkan ke dalam well plate dengan katalis yang membantu mempercepat reaksi oksidatif. Setelah inkubasi singkat, probe DCFH yang telah disiapkan ditambahkan ke semua well dan reaksi oksidasi dibiarkan berlangsung. Sampel diukur secara fluorometrik terhadap standar hidrogen peroksida atau DCF. Uji dilakukan dalam format platt fluoresensi 96 well yang kemudian dibaca menggunakan mesin fluorescence plate reader standar. Kadar radikal bebas dalam sampel ditentukan dengan membandingkannya dengan kurva standar DCF atau hidrogen peroksida yang telah ditentukan sebelumnya.

Referensi:

1. Product Manual OxiSelect™ Intracellular ROS Assay Kit (Green Fluorescence)
2. Product Manual OxiSelect™ In Vitro ROS/RNS Assay Kit (Green Fluorescence)