Genotyping qPCR merupakan metode yang menggunakan quantitative PCR (qPCR) untuk menentukan genetik makeup (genotype) individu pada lokasi spesifik pada genome. qPCR merupakan metode kuantitatif yang cepat, spesifik dan sensitif untuk genotyping individu transgenik. Metode qPCR juga merupakan alat yang “valuable” untuk genotyping, khususnya untuk deteksi Single Nucleotide Polymorphism (SNPs). Metode ini bergantung pada primer spesifik dengan alel, probes yang juga spesifik, mesin qPCR yang digunakan untuk amplifikasi dan mendeteksi DNA sekuens yang berkaitan dengan varian genetik spesifik. Hal ini dapat menghasilkan identifikasi yang akurat dan efisien untuk genotipe yang berbeda di dalam sampel.

Komponen kunci dalam genotyping metode qPCR antara lain mesin qPCR, Primer, probes, master mix, Internal Positive Control (IPC) dan DNA Template. Adapun definisi dan dari beberapa komponen kunci dalam genotyping qPCR adalah sebagai berikut:

1. Mesin qPCR: mesin qPCR atau yang juga disebut sebagai mesin RT-PCR/RT-PCR Analyzer merupakan instrumen laboratorium khusus yang dapat melakukan amplifikasi dan deteksi DNA real-time. Instrumen ini juga dapat digunakan untuk melakukan kuantifikasi pada sekuens DNA spesifik pada sample. Cara kerja instrumen ini adlah dengan menghasilkan siklus termal (heating and cooling) yang dibutuhkan untuk PCR juga sebagai sumber dan detektor cahaya yang dibutuhkan untuk mengukur sinyal fluoresens. Salah satu contoh dari RT-PCR analyzer dari Bio-Gener company dapat dilihat pada link berikut: https://indogen.id/q1600-real-time-pcr/
2. Primer: Primer berfungsi untuk berikatan dengan sekuens DNA spesifik yang membedakan dengan single nucleotide (SNP). Primer PCR merupakan sekuens pendek DNA spesifik yang umumnya terdiri dari 18-22 untai basa dan digunakan untuk memulai amplifikasi DNA. Komponen ini juga digunakan sebagai penentu spesifitas DNA amplifikasi dan harus komplementer dengan urutan DNA target. Hal ini dibutuhkan untuk proses penempelan (annealing) dan memulai proses perpanjangan untai DNA oleh enzim DNA polimerase. Terdapat dua jenis primer yaitu primer forward dan primer reverse yang dapat digunakan dalam genotyping metode qPCR. Pemilihan primer yang buruk dapat menyebabkan hasil PCR tidak spesifik, lemah atau bahkan tidak akan terjadi amplifikasi sama sekali.
3. Probes: Probes umumnya merupakan molekul DNA single stranded yang pendek berlabel fluoresens. Probes dapat untuk mendeteksi DNA yang teramplifikasi jika telah hibridisasi dengan urutan sekuens yang ditargetkan. Diawali dengan hibridisasi probe dengan sekuens target, enzim polimerase akan membelah probe, dan memungkinkan fluorofor memancarkan cahaya dan dapat menunjukkan keberadaan dan jumlah target DNA. Jenis pewarna fluoresens yang berbeda dapat digunakan untuk menunjukkan jenis alel yang berbeda.
4. Master mix: master mix merupakan seperangkat reagen yang didalamnya termasuk DNA polimerase, dNTPS, ion magnesium dan reagen lainnya yang dibutuhkan untuk reaksi PCR. Berikut contoh master mix dari Brand Solarbio:

Metode Genotyping pada qPCR

a. Primer Design

Desain primer untuk genotyping pada qPCR merupakan langkah utama yang akan menentukan keberhasilan amplifikasi target gen. Langkah menentukan desain primer untuk genotyping qPCR diawali dengan menentukan target gen spesifik yang ingin diamplifikasi. Hal ini juga melibatkan penentuan urutan nukleotida gen target. Penentuan urutan nukleotida gen target ini menggunakan database genetik seperti GeneBank pada NCBI.

b. Amplifikasi DNA

Amplifikasi DNA pada qPCR dimulai dengan pemisahan double strand DNA secara enzimatik. Diawali dengan denaturasi protein yang akan memisahkan untai ganda DNA menjadi untai tunggal. Elongasi dibantu oleh enzim DNA Polimerase yang menambahkan DNA untuk memperpanjang primer dan melakukan penyalinan untai DNA target. Siklus ini akan diulang dan menghasilkan jutaan copy DNA. Deteksi kuantitatif DNA menggunakan pewarna fluoresens dengan hibridisasi probes DNA yang terikat pada target DNA.

c. Pengukuran Kuantitatif

Data fluoresens yang diperoleh selama siklus qPCR membentuk kurva amplifikasi yang menunjukkan peningkatan jumlah DNA target sesuai dengan siklus. Nilai Cycle Threshold (Ct) diukur pada saat amplifikasi mulai terdeteksi secara signifikan diatas baseline. Semakin rendah nilai Ct, semakin tinggi jumlah DNA target dalam sampel.

Pada dasarnya genotyping menggunakan metode qPCR memiliki beberapa keunggulan seperti kemampuan untuk kuantifikasi secara langsung, serta sensitivitas dan spesifitas yang tinggi. Aplikasi qPCR digunakan untuk deteksi dan kuantifikasi patogen, analisis ekspresi gen, deteksi mutasi, uji forensik dan penelitian biologi molekuler.

Source:

Hudson TJ, Clark CD, Gschwend M, Justice-Higgins E. PCR methods of genotyping. Curr Protoc Hum Genet. 2001 May;Chapter 2:Unit 2.5. doi: 10.1002/0471142905.hg0205s12. PMID: 18428269.

Li K, Brownley A. Primer design for RT-PCR. Methods Mol Biol. 2010;630:271-99. doi: 10.1007/978-1-60761-629-0_18. PMID: 20301004.