Epigenetik merupakan mekanisme yang memodifikasi ekspresi gen dan menentukan hasil akhir dari lokus genetik tanpa mengubah urutan DNA yang bersangkutan. Perubahan epigenetika tersebut dapat berupa modifikasi kovalen dan non-kovalen, serta terjadi pada molekul DNA dan kromatin. Perubahan epigenetika yang telah secara ekstensif diteliti yakninya metilasi DNA dan modifikasi histon pasca-translasi.

1. Definisi Metilasi DNA

Metilasi DNA adalah perubahan kimia secara kovalen pada kromatin. Metilasi DNA bersifat reversibel dan terjadi pada karbon ke-5 sitosin DNA. DNMT (DNA metiltransferase) memediasi proses pengikatan kovalen antara gugus metil dan 5mC (C-5 dari cincin sitosin). Pada sel mamalia, metilasi DNA sebagian besar ditemukan pada CpG dinukleotida (sitosin diikuti oleh residu guanin). Setelah replikasi DNA terjadi, hanya metilasi DNA simetris pada situs CpG yang akan tersisa dari setelah replikasi tersebut. Metilasi DNA juga dapat secara tidak langsung mengubah genom. Situs CpG yang termetilasi dapat mengalami mutasi spontan melalui deaminasi yang menyebabkan transisi C menjadi T. Dengan demikian, metilasi DNA mengurangi kandungan CpG di genom.

Metilasi pada promotor dan area distal regulator gen berfungsi untuk mengendalikan ekspresi gen. Kadar metilasi DNA yang tinggi berhubungan dengan supresi transkripsi dan beberapa mekanisme regulasi ekspresi gen. Misalnya, metilasi dapat mencegah pengikatan faktor transkripsi sehingga menghambat inisiasi transkripsi. Sejauh ini telah dilaporkan bahwa  seperlima (21.6%) faktor transkripsi menunjukkan supresi pengikatan situs target rekognisi sekuens dengan keberadaan metilasi. Selain itu, enzim pada proses metilasi DNA dapat mengubah kromatin, sehingga metilasi DNA berkontribusi pada struktur kromatin. Selain pada promotor dan area distal regulator, metilasi DNA juga dapat terjadi di luar area tersebut, pada TSS (transcription starting site), yang secara spesifik pada badan gen dan unsur repetitif gen.

Kejadian metilasi DNA terdiri dari metilasi de novo (baru), metilasi maintenance dan demetilasi.

• Metilasi de novo dihasilkan dengan bantuan DNMT3A (DNA methyltransferase 3 alpha) dan DNMT3B (DNA methyltransferase 3 beta) pasca-replikasi DNA.
• Metilasi maintenance yaitu terjadi saat DNMT1 (DNA methyltransferase 1) me-metilasi untai DNA yang baru disintesis selama replikasi sehingga metilasi dipertahankan setelahnya.
• Sekelompok enzim metilsitosin dioksigenase TET (ten-eleven translocation) berperan dalam demetilasi DNA aktif dengan mengoksidasi 5meC (5-metilsitosin) menjadi 5hmC (5-hidroksimetilsitosin), 5fC (5-formilsitosin) dan 5caC (5-karboksilsitosin), dimana bentuk-bentuk teroksidasi ini dapat di-demetilasi selama replikasi DNA.

Berbagai pengujian dan platform tersedia untuk mempelajari metilasi DNA. Saat ini, metode berbasis PCR adalah metode yang paling umum digunakan untuk investigasi lokus-lokus spesifik, sedangkan metode berbasis elektroforesis, microarray, dan sekuensing paralel high-throughput diperuntukkan untuk skala genom. Sebagian besar aplikasi-aplikasi tersebut memerlukan pretreatment DNA seperti konversi bisulfit dengan natrium bisulfit (NaHSO3) untuk DNA terdenaturasi, enzim restriksi sensitif-metilasi (endonuklease) dan metode imunopresipitasi. Konversi bisulfit memungkinkan sitokin termetilasi tidak tidak terpengaruh saat sitokin non-metilasi berubah menjadi urasil (urasil akan diaplikasikan sebagai timin dengan PCR)

Metode terhandal aplikasi metilasi DNA yaitu bisulfite sequencing diikuti oleh amplifikasi PCR dan direct sequencing atau sequencing after cloning. Bisulfite sequencing juga dapat menggunakan baik, Sanger sequencing untuk mempelajari lokasi genomik lebih kecil, atau WGS (whole-genome sequencing) untuk skrining global. Metode sekuensing lain untuk profiling metilasi seluruh genom dari CpG islands dan sekuens repetitif yaitunya dengan RRBS (reduced-representation bisulfite sequencing) atau TGS (third-generation sequencing).

Gambar 1. Gen terbuka (aktif, non-metilasi) dan tidak terbuka (nonaktif, termetilasi)

Biomarker darah selalu menjadi yang paling diminati dan mudah digunakan, serta menawarkan persetujuan pasien yang lebih besar dibandingkan specimen lainnya. Secara umum, sebagian besar biomarker kanker dari plasma berupa protein atau glikoprotein (PSA, CEA, dan CA-125). Beberapa biomarker metilasi diagnostik berbasis plasma antara lain, ALX4, APC, CDKN2A, HLTF, HPP1, MLH1, MGMT, NEUROG1, NGFR, RASSF2A, SFRP2, VIM, WIF1, 4GAT1, BCAT1, IKZF1, SFRP1, SDC2, dan PRIMA1.

2. Fungsi Normal Metilasi DNA

Metilasi DNA memiliki bermacam kontribusi pada berbagai fungsi tubuh normal. Salah satu kontribusi tersebut yaitu pembentukan heterokromatin. Kromatin silent (struktur represif yang menghambat ekspresi gen) menunjukkan pola karakteristik metilasi DNA dan protein pengikatnya yang dikombinasikan dengan modifikasi RNA dan histon. Metilasi DNA pada area promotor dan TSS dapat men-silencing aktivitas transkripsi suatu gen. Sedangkan di luar TSS, metilasi DNA dapat berkontribusi pada elongation dan splicing transkripsi itu sendiri, serta juga mengontrol daerah isolator dan enhancer. Peran metilasi DNA juga penting dalam men-silencing sekuens repetitif (seperti LINE1, Alu, dan retrovirus) serta metilasi sekuens sentromerik mampu mencegah unsur transposabel berpindah ke dalam genom, sehingga stabilitas kromosom dan genom tetap terjaga. Selain itu studi metilasi DNA pada model hewan coba tikus dengan defisiensi DNMT telah menunjukkan gangguan perkembangan

Genom mamalia menunjukkan metilasi DNA hingga 70–80% pada genom. CpG islands memiliki komposisi CpG dinukleotida sangat tinggi dibandingkan dengan sebagian besar komponen DNA lainnya. Promotor manusia umumnya memiliki banyak CpG islands, terutama promotor gen-gen housekeeping dan gen developmentally regulated, dimana CpG islands tumpang tindih dengan TSS. Contoh lain fungsi normal metilasi DNA yaitu men-silencing sekuens-sekuens repetitif dan sentromerik, represi transposon, inaktivasi salah satu kromosom-X wanita (disebut badan Barr), serta genomic imprinting.

3. Sel Kanker dan Metilasi DNA

Metilasi DNA merupakan salah satu mekanisme epigenetik utama kanker dan dapat dihubungkan dengan semua ciri spesifik kanker. Peristiwa hipermetilasi DNA mampu menonaktifkan TSG (tumor suppressor genes), segangkan hipometilasi dapat mengaktifkan proto-onkogen (gen-gen terlibat dalam pertumbuhan sel normal) sehingga  menyebabkan proliferasi abnormal dengan mempertahankan sinyal proliferatif sehingga akan mempengaruhi gen dan jalur lain yang berkenaan dengan kanker.

a. Evasi supresor pertumbuhan: RB1 dan TP53

Evasi atau penghindaran supresor pertumbuhan negatif dapat terjadi dengan meregulasi protein Rb (Retinoblastoma) dan jalur p53 yang berperan dalam regulasi pembelahan sel dan siklus sel. Metilasi DNA pada gen RB1, yang merupakan TSG, sering kali men-silencing ekspresi protein Rb di berbagai kanker. Silencing gen TP53 (pengkode protein p53) dengan metilasi DNA juga mampu menyebabkan resistensi terhadap apoptosis sel oleh sel kanker.

b. Proses angiogenesis: VHL dan THBS1

Induksi angiogenesis merupakan suatu keharusan untuk pertumbuhan tumor. Induksi angiogenesis ini diregulasi salah satunya oleh gen VHL (von Hippel-Lindau), salah satu TSG, yang berperan dalam menurunkan regulasi banyak molekul angiogenik. Pada sebagian besar tumor, gen VHL ditemukan sering kali mengalami hipermetilasi. Metilasi DNA pada THBS1 (trombospondin-1) juga merupakan mekanisme pro-angiogenik pada kanker.

c. Mekanisme EMT dan gen-gen EMT

EMT (epithelial-to-mesenchymal transition) yaitu mekanisme yang berkaitan dengan karsinogenesis, terutama invasi dan metastasis tumor yang berasal dari sel epitel. EMT umumnya merupakan peristiwa perkembangan yang memungkinkan sel untuk bermigrasi, tetapi dalam kasus sel kanker, sel mengalami program de-differensiasi yang diakibatkan oleh perubahan ekspresi. Metilasi DNA berperan dalam mengubah ekspresi gen-gen EMT, misalnya dengan men-silencing CHD1 (pengkode E-cadherin). EMT juga dapat mendorong plastisitas sel kanker dan evasi sistem imun.

d. Evasi sistem imun

Dalam evasi sistem imun, metilasi DNA sangat krusial dalam regulasi komponen jalur imun. Hipometilasi gen checkpoint imun dan hipermetilasi gen costimulatory merupakan kejadian yang sering terjadi pada tumor padat (solid tumor). Sebagai contoh, metilasi PD-L1 (ligan reseptor checkpoint imun PD-1) berbanding terbalik dengan ekspresi PD-L1, dimana dengan adanya PD-L1, menyebabkan hilangnya sel T (yaitu gangguan fungsional) sehingga evasi imun terjadi. Contoh lainnya, metilasi DNA sangat penting untuk menginduksi respons inflamasi pada TAM (tumor-associated macrophages). TAM merupakan sel imun sangat plastis yang diregulasi oleh berbagai stimulus dan mekanisme epigenetik. TAM merupakan komponen utama  tumor microenvironment dan terlibat dalam peristiwa tumorigenik (misalnya, angiogenesis, evasi imun, inflamasi pendorong tumor, pertumbuhan tumor, dan metastasis).

e. Penyerapan glukosa oleh sel kanker

Dalam kasus sel kanker, penyerapan glukosa akan mengalami peningkatan dan sebagian besar proses metabolisme melalui glikolisis anaerobik dibandingkan proses fosforilasi oksidatif meskipun oksigen tersedia. Proses ini dikenal sebagai Warburg effect. Peningkatan penyerapan glukosa dapat disebabkan oleh silencing epigenetik gen tertentu, seperti hipermetilasi promotor VHL dapat menginduksi ekspresi konstitutif HIF1α pada karsinoma ginjal yang mengakibatkan peningkatan glikolisis, atau metilasi DNA pada gen DERL3 mampu meningkatkan GLUT1 yang berperan sebagai transporter glukosa. Hipoksia dapat menekan aktivitas enzim TET dan mendorong hipermetilasi DNA pada promotor TSG pada sel kanker. Sebagai mekanisme epigenetik tidak langsung, mutasi pada protein TET mampu meningkatkan ketidakstabilan genom dan meregulasi perbaikan (repair) DNA.

f. DNA mismatch repair (MMR) dan microsatellite

Dalam kanker kolorektal, microsatellite instability (diakibatkan metilasi promoter MLH1) dan chromosomal instability (CIN, diakibatkan hipometilasi LINE-1) merupakan contoh kasus yang sering kali dibahas.

• MLH1 (MutL protein homolog 1) merupakan gen repair DNA dan inaktivasi gen ini mampu merusak sistem DNA mismatch repair serta menyebabkan mutasi pada mikrosatelit (sekuens repetitif pendek). Hal ini meningkatkan ketidakstabilan genom dan menyebabkan fenotipe hipermutabel.
• LINE-1 (long interspersed nuclear element-1) merupakan sekuens repetitif transposabel yang mencakup sekitar 18% genom manusia. Gen ini umumnya sangat termetilasi, namun dapat mengalami hipometilasi pada kanker (marker hipometilasi keseluruhan/global). Hipometilasi DNA global memfasilitasi hilangnya genomic imprinting, CIN dan peningkatan laju mutasi lebih lanjut.

g. Peningkatan ketidakstabilan genom: MLH1 dan MGMT

Bergantung pada mekanisme perbaikan manakah yang terganggu, inaktivasi fungsi perbaikan DNA kemungkinan peningkatan frekuensi mutasi. Baik kanker sporadis atau sindrom predisposisi kanker familial, terutama malignansi kolorektal dengan microsatellite instability, berkaitan dengan mutasi pada gen DNA mismatch repair (DNA MMR). Meskipun sindrom Lynch disebabkan oleh mutasi bawaan pada gen DNA mismatch repair (MSH2, MLH1, MSH6, atau PMS2), mayoritas tumor kolorektal sporadis yang mengalami defisiensi mismatch repair tidak mengandung mutasi. Sebaliknya, promotor gen MLH1 sering kali mengalami hipermetilasi, dan inaktivasi oleh metilasi biallelic menyebabkan hilangnya produksi protein. Inaktivasi gen MLH1 merupakan gambaran meyakinkan dari metilasi pendorong karsinogenesis karena menyebabkan hilangnya fungsi yang mirip dengan mutasi gen.

Pemeriksaan metilasi promoter MLH1 somatik merupakan biomarker epigenetik yang paling banyak digunakan dalam praktik klinis diagnosis kanker kolorektal saat ini. Pemeriksaan ini dapat menunjukkan hilangnya ekspresi protein MLH1 dan/atau PMS2. Pasien dengan kanker kolorektal tanpa ekspresi MLH1, analisis hipermetilasi MLH1 banyak digunakan dalam praktik klinis untuk membedakan antara sindrom Lynch dan kanker kolorektal sporadis dengan defisiensi MMR. Pengujian universal protein MMR dan/atau analisis MSI pada pasien kanker kolorektal merupakan metode yang direkomendasikan untuk mengidentifikasi pasien sindrom Lynch.

MGMT (O6-methylguanine methyltransferase) adalah gen perbaikan DNA yang mengkode protein perbaikan DNA dengan menghilangkan gugus alkil mutagenik dan sitotoksik dari posisi O6 guanin dan mengembalikan guanin ke keadaan semula. Dengan pairing timin dibandingkan sitosin selama replikasi DNA, metilasi guanin-O6 menghasilkan nukleotida termetilasi dengan potensi pasangan basa yang rusak, sehingga mendorong mutasi G:C menjadi A:T. Promotor gen tersebut memiliki banyak CpG dan dinonaktifkan melalui metilasi DNA, sehingga metilasi silencing pada MGMT dapat mengurangi efisiensi perbaikan O6-alkilguanin. MGMT nonaktif dapat ditemukan pada kanker kolorektal, gastrik, NSCLC (non-small-cell lung cancers), karsinoma sel skuamosa kepala-leher dan glioma. Pasien glioma dengan MGMT termetilasi terbukti memiliki tingkat kelangsungan hidup lebih tinggi saat pengobatan dengan agen alkilasi TMZ dibandingkan pasien dengan promotor yang tidak termetilasi.

Tabel 1. Kit analisis metilasi DNA dan mutasi dengan metode Real-Time PCR dan ELISA

 4.   Referensi

1. Jianjun Chen, G. Greg Wang), Jun Lu. 2023. Epigenetics in Oncology. Springer.
2. Trygve O. Tollefsbol. 2023. Handbook of Epigenetics The New Molecular and Medical Genetics. 3rd Edition. Academic Press.
3. Rasime Kalkan. 2023. Cancer Epigenetics.Springer.
4. Miriam Galvonas Jasiulionis. 2022. Epigenetics and DNA Damage. Academic Press.
5. Sevgi Durna Daştan, Nazan Yurtcu. 2022. Epigenetics: Beyond the Genetics and Medicine. Nova Science Publishers.