Dalam dua dekade terakhir, kemajuan teknik biologi molekuler semakin meningkat dengan penemuan teknik-teknik baru dan metode yang lebih unggul yang melampaui teknik konvensional seperti PCR dan pendahulunya.

1. RNA-Seq

RNA-Seq (RNA-Sequencing) adalah teknik yang memanfaatkan next-generation sequencing (NGS) untuk menunjukkan keberadaan dan kuantitas RNA dalam sampel biologis. RNA-Seq memberikan gambaran (snapshot) ekspresi gen dalam sampel yang disebut transkriptom. Teknik ini memungkinkan untuk mendeteksi dan mengkuantifikasi RNA pada kondisi waktu tertentu untuk mendapatkan informasi tentang aktivasi dan inaktivasi gen. Teknik ini memiliki banyak keunggulan diantaranya untuk mempelajari spliced transcripts gen alternatif untuk menunjukkan isoform gen berbeda, membantu mengidentifikasi modifikasi RNA dan variasi genetik, mendeteksi peristiwa fusi antar gen berbeda, memantau perubahan ekspresi gen dari waktu ke waktu, membandingkan ekspresi gen pada berbagai kelompok perlakuan serta menganalisis jenis-jenis RNA (RNA total, small RNA, tRNA, dan RNA ribosom).

Teknik RNA-seq dapat dilakukan dengan mengisolasi RNA, mengkonversinya menjadi DNA (cDNA) libraries, sekuensing libraries dengan NGS, menyelaraskan sekuens dengan genom referensi serta kemudian kuantifikasi RNA. Terdapat beberapa keunggulan penting dari teknik ini dibandingkan teknik Microarray dengan mengatasi kekurangannya, antara lain artefak hibridisasi silang, kuantifikasi buruk gen ekspresi rendah dan tinggi dan kebutuhan untuk pengetahuan mengenai sekuens sebelum sequencing. Sebaliknya, teknik alternatif ini dapat memberikan data ekspresi gen lebih akurat dan komprehensif dibandingkan Microarray.

Instrumentasi RNA-Seq pada dasarnya menggunakan platform NGS, seperti Illumina HiSeq, Illumina NovaSeq, Ion Torrent dan Library Preparation Kits. Libraries dapat dipreparasi menggunakan kit komersial dari Illumina, New England Biolabs (NEB) atau Qiagen. Komponen umum kit komersial tersebut mencakup reagen untuk reverse transcription, fragmentasi, ligasi adaptor dan amplifikasi PCR.

2. Whole Genome Sequencing (WGS)

Whole Genome Sequencing (WGS) dikenal sebagai sequencing genom penuh (lengkap atau keseluruhan) merupakan proses penentuan hampir keseluruhan atau keseluruhan sekuens DNA dari genom organisme. Teknik WGS memberikan pandangan komprehensif tentang susunan genetik, termasuk daerah coding (ekson) dan non-coding. WGS dapat diimplementasikan untuk semua kromosom, kromosom seks, DNA mitokondria dan elemen genom lainnya. Teknik ini dapat dilakukan dengan ekstraksi DNA genom, fragmentasi DNA dan preparasi sequencing libraries, kemudian menggunakan platform NGS untuk membaca sekuens basa. Data dianalisis dilakukan dengan menyelaraskan pembacaan yang disekuens terhadap genom referensi, mengidentifikasi varian dan memberi anotasi pada unsur fungsional. Kit komersial dapat digunakan dalam preparasi libraries dan diperoleh dari Illumina, PacBio atau penyedia lain untuk melakukan langkah fragmentasi DNA, ligasi adaptor dan amplifikasi. Instrumentasi WGS termasuk Illumina HiSeq X Ten, Illumina NovaSeq, PacBio Sequel dan Oxford Nanopore MinION.

Aplikasi WGS mencakup deteksi varian genetik [polimorfisme nukleotida tunggal (SNP), insersi, delesi, varian struktural, keragaman genetik], diagnostik penyakit akibat mutasi dan kelainan genetik langka, serta studi evolusi. WGS dapat memberikan peta informasi genetik yang komprehensif, mendeteksi varian umum dan langka, serta memungkinkan pengobatan dipersonalisasi dan presisi onkologi. Terlepas dari keunggulannya, WGS juga memiliki keterbatasan, antara lain menghasilkan data jumlah besar, memerlukan biaya tinggi, interpretasi kompleks serta pertimbangan informasi genetik mengenai etika dan privasi.

3. Whole Exome Sequencing (WES)

Whole Exome Sequencing (WES) adalah teknik genomik yang berfokus pada sekuensing semua wilayah pengkode protein (ekson) dalam genom. WES berfungsi dalam mengidentifikasi varian genetik yang mengubah sekuens protein. Teknik ini terdiri dari dua langkah utama, yaitu seleksi target dan sekuensing. Seleksi target melibatkan penangkapan DNA eksonik secara selektif dari sampel DNA, kemudian disekuens menggunakan teknologi sekuensing DNA untuk jumlah besar dikarenakan ada sekitar 180.000 ekson (1%) dalam genom manusia. Deteksi varian relevan bertujuan untuk mendapatkan sekuensing yang jauh lebih murah dibandingkan dengan sekuensing keseluruhan genom. Instrumentasi WES termasuk Illumina HiSeq, Agilent SureSelect dan IDT xGen.

WES dapat digunakan untuk mempelajari penyakit Mendel langka. Penyakit-penyakit ini disebabkan oleh varian sangat langka dan pada beberapa individu saja. Selain biayanya lebih rendah dibandingkan WGS, alat ini juga dapat mendeteksi varian relevan (target) dalam jumlah besar, serta sering digunakan dalam riset akademis dan diagnostik klinis. Berbeda dengan array SNP, susunan ini dapat mengidentifikasi varian spesifik pada individu dibandingkan dengan mendeteksi pada populasi besar. Untuk memperoleh ekson, terdapat tiga metode yang dapat dilakukan yaitu target-enrichment strategies, array-based hybrid capture dan in-solution capture. Target-enrichment method secara selektif menangkap wilayah genom yang diminati, yaitu seluruh eksome. Array-based hybrid capture adalah metode NGS yang melibatkan penggunaan umpan (probe) oligonukleotida panjang dan terbiotinilasi untuk hibridisasi selektif ke wilayah eksonik (wilayah coding). In-solution capture juga merupakan metode NGS yang menggunakan probe RNA atau DNA yang terbiotinilasi khusus untuk dapat dicocokan dengan sekuens target.

4. Nano String

Teknologi NanoString adalah sistem kuantifikasi molekul tunggal yang yang bekerja dengan menempelkan barcode molekuler ke molekul target menggunakan pasangan basa asam nukleat. Ada beberapa langkah dalam NanoString secara berturut-turut meliputi desain probe (probe RNA atau DNA terbiotinilasi khusus), hibridisasi (probe hibridisasi dengan DNA genom untuk membentuk kompleks DNA-probe), penangkapan (bead magnetik tercoating streptavidin menangkap kompleks), elusi (DNA yang tertangkap dielusi dari bead magnetik), dan sekuensing (DNA yang diperoleh dilanjutkan dengan NGS).

Teknologi ini memiliki beberapa keunggulan diantaranya spesifisitas, efisiensi biaya (dibandingkan WGS), presisi tinggi (barcode dengan kode warna sesuai) dan penghitungan target tunggal tanpa amplifikasi. Berbeda dengan PCR tradisional, NanoString secara langsung dapat memprofilkan masing-masing molekul, tanpa bergantung pada intensitas sinyal atau fluoresensi yang diakibatkan oleh bias amplifikasi. NanoString menawarkan beberapa platform yang diketahui hingga saat ini, seperti nCounter® Analysis System, GeoMx® Digital Spatial Profiler (DSP), dan CosMx™ Spatial Molecular Imager (SMI). Platform nCounter® Analysis System diadopsi untuk validasi dan penerjemahan diskoveri menjadi pengujian diagnostik yang berguna dalam klinis.

5. Nanopore

Nanopore sequencing merupakan sekuensing satu molekul DNA atau RNA tanpa amplifikasi PCR atau pelabelan kimia dengan mengandalkan proses pelewatan molekul melalui pori berukuran nano (nanopore) dan mengukur variasi arus ionik yang dihasilkan. Operasi teknik ini secara umum serupa dengan teknik NanoString. Keunggulan metode Nanopore meliputi resolusi molekul tunggal (masing-masing molekul tersekuens), hemat biaya, mampu identifikasi patogen secara cepat dan hasil secara real-time. Platform instrumentasi nanopore portabel juga memungkinkan sekuensing dilakukan hampir di mana saja bahkan di daerah terpencil. Aplikasi teknik ini dapat diterapkan dalam genotipe, identifikasi patogen, monitoring lingkungan, sekuensing genom manusia, monitoring resistensi antibiotik dan haplotyping (penentuan variasi genetik pada satu kromosom). Instrumentasi dan platform khusus yang digunakan dalam Nanopore antara lain MinION (portable), GridION, PromethION (high-throughput), Flongle (portable), NabSys (solid-state nanopores) dan Sequenom.

6.  Referensi

1. Alharbi WS, Rashid M. 2022. A review of deep learning applications in human genomics using next-generation sequencing data. Hum Genomics 16: 26.
2. Baylor Genetics. Whole Exome Sequencing.
3. Chaisson M, Wilson R, Eichler E. 2015. Genetic variation and the de novo assembly of human genomes. Nat Rev Genet. 16: 627–640.
4. Curry PDK, Broda KL, Carroll CJ. 2021. The Role of RNA-Sequencing as a New Genetic Diagnosis Tool. Curr Genet Med Rep 9: 13–21.
5. Goto Y, Akahori R, Yanagi I. et al. 2020. Solid-state nanopores towards single-molecule DNA sequencing. J Hum Genet 65: 69–77.
6. Haque A, Engel J, Teichmann SA et al. 2017. A practical guide to single-cell RNA-sequencing for biomedical research and clinical applications. Genome Med 9: 75.
7. Klein H-G, Bauer P, Hambuch T. 2014. Whole genome sequencing (WGS), whole exome sequencing (WES) and clinical exome sequencing (CES) in patient care. LaboratoriumsMedizin. 38(4): 221-230.
8. Kono N, Arakawa K. 2019. Nanopore sequencing: review of potential applications in functional genomics. Develop. Growth Differ. 61: 316–326
9. Lin B, Hui J, Mao H. Nanopore Technology and Its Applications in Gene Sequencing. Biosensors. 2021; 11(7):214.
10. Nanostring. NanoString: Experience the Power of Spatial Biology.
11. Pal A. 2022. RNA Sequencing (RNA-seq). In: Protocols in Advanced Genomics and Allied Techniques. Springer Protocols Handbooks. Springer.
12. Rodriguez-Esteban R, Jiang X. 2017. Differential gene expression in disease: a comparison between high-throughput studies and the literature. BMC Med Genomics. 10: 59.