Teknik ELISPOT (Enzyme-Linked ImmunoSpot)

ELISPOT (Enzyme-Linked ImmunoSpot) berasal dari teknik ELISA, suatu teknik yang serupa dengan ELISPOT, dan bintik-bintik (spots) digunakan sebagai hasil pembacaan pengujian. ELISPOT merupakan metode yang awalnya diciptakan pada tahun 1983 untuk mendeteksi produksi bakteri enterotoksin termofobik, dan saat ini digunakan untuk penghitungan sel B spesifik sekresi antibodi. Format pengujian tersebut diadaptasi untuk mendeteksi sel yang mensekresi sitokin dan hingga saat ini dengan prinsip pengujian yang sama.

Keunggulan ELISPOT:

• Memungkinkan untuk memeriksa sel pada tingkat sel tunggal
• Memiliki sensitivitas tinggi
• Merupakan pengujian fungsional
• Mudah dipelajari dan diadaptasi
• Merupakan pengujian yang andal
• Dapat diadaptasi untuk high-throughput (sampel besar)

Prinsip ELISPOT

ELISPOT memungkinkan penghitungan sel tunggal yang mensekresikan analit spesifik (analit = zat yang diukur atau “dianalisis”). Prasyarat utama ELISPOT adalah tersedianya antibodi, optimalnya berupa pasangan antibodi yang dapat berikatan dengan analit. Keuntungan menggunakan pasangan antibodi, di mana masing-masing antibodi mengenali epitop analit yang berbeda.

Secara umum, jika suspensi sel tunggal dan antibodi mengenali analit yang disekresikan oleh sel tersebut tersedia, maka metode ELISPOT mungkin digunakan untuk menghitung berapa banyak sel dalam suspensi tersebut yang mensekresi analit target tersebut (misalnya, IFNɣ) dalam kondisi tertentu (misalnya, saat sel imun terpapar antigen). Cara termudah yaitu dengan imobilisasi antibodi pada 96-well plate berlapis membran. Suspensi sel ditambahkan ke sumuran plate kemudian diinkubasi, dalam berbagai kondisi dalam waktu singkat (beberapa jam hingga hari) untuk memungkinkan sel mensekresikan analit. Setelah analit disekresikan, antibodi terimobilisasi pada dasar membran sumur tersebut akan menangkap analit melalui pengikatan non-kovalen afinitas tinggi. Suspensi sel dihilangkan dan antibodi lain pengenal analit ditambahkan. Antibodi kedua sebaiknya mengenali epitope analit berbeda lainnya untuk pengikatan optimal. Hasil berupa kompleks sandwich antara analit (tengah) dan dua antibodi. Antibodi pendeteksi yaitu antibodi sekunder terbiotinilasi (terikat kovalen dengan biotin) untuk memungkinkan amplifikasi sinyal. Setelah penambahan bertahap kompleks enzim streptavidin dan substrat dimana substrat dikonversi akan mengendap pada membran di lokasi tempat penangkapan analit target, sehingga membentuk bintik-bintik (spots) berwarna.

Gambar 1. Human IFN-Gamma ELISPOT Kit Merk Dakewe

Hasil pengujian ELISPOT berupa bintik-bintik berwarna pada membran. Satu titik adalah jejak satu sel yang mengeluarkan analit target. Morfologi titik sebenarnya mencerminkan kinetika sekresi analit. Setelah analit disekresikan, analit tersebut langsung ditangkap oleh antibodi pelapis di sekitar sel. Semakin banyak analit yang disekresikan (dan semakin cepat), semakin jauh analit tersebut dapat berdifusi keluar dari sel sehingga penangkapan mengikuti gradien konsentrasinya, kemudian sepenuhnya terikat oleh pilihan antibodi penangkap. Proses difusi dan penangkapan ini menentukan penampakan bintik secara keseluruhan, umumnya bagian tengah lebih gelap (konsentrasi analit terikat tinggi) dengan intensitas warna memudar pada pinggiran bintik (konsentrasi analit terikat menurun).

Gambar 1. Bintik-bintik hasil pengujian ELISPOT.

Langkah-langkah pengujian ELISPOT adalah:

1.  Memilih reagen dan bahan yang benar
2.  Menyiapkan sampel
3.  Melakukan pengujian
4.  Menghitung bintik-bintik
5.  Menganalisis data

ELISPOT yang tepat harus memiliki:

• Bintik-bintik kecil dan jelas
• Distribusi titik merata di seluruh sumuran
• Tidak adanya artefak
• Tidak adanya pewarnaan background (peningkatan pewarnaan membran)
• Tidak adanya atau sangat rendahnya reaktivitas background (minimumnya bintik pada sumuran kontrol negatif)
• Tidak ada bintik positif palsu
• Rendahnya variabilitas antar sumuran replikasi
• Kontrol positif berfungsi dengan baik
• Kontrol tren/kurva juga penting
• Pengulangan (ketepatan)
• Akurasi (pengukuran mendekati nilai sebenarnya)

ELISPOT wajib terdiri dari komponen-komponen berikut:

• 96-well plate berlapis membran
• Antibodi untuk pelapisan dan deteksi
• Konjugat dan Substrat Enzimatik
• Media Kultur
• Blocking Buffer
• Washing Buffer

Alat-alat laboratorium yang penting untuk pekerjaan ELISPOT dan preparasi sel/jaringan:

• Pipettor dan pipet serologis semua ukuran
• Filter (mis. filter pengikat protein rendah, ukuran pori 0,22 μm)
• Tabung dan Rak
• Jarum suntik
• Sarung tangan
• Elispot Reader Otomatis (sistem pencitraan otomatis)

Proses Coating

Langkah coating memakan waktu hingga beberapa jam dan biasanya dilakukan dalam waktu semalam. Tidak dianjurkan melakukan pengujian ELISPOT secara spontan. Well-plate yang telah ter-coating alangkah baiknya telah disediakan oleh produsen komersial sebagai alternatif yang mudah dan dengan reprodusibilitas tinggi. Ketidakkonsistenan dalam in-house ELISPOT dapat menghasilkan variabilitas tinggi antar sumuran dan dapat menyebabkan sumuran yang tidak digunakan menunjukan bintik samar saat proses washing akibat error dalam desain in-house.

Tahap Deteksi

Antibodi pendeteksi biotinilasi digunakan di ELISPOT untuk melakukan amplifikasi sinyal. Manufaktur dan produsen komersial saat ini sudah melabelkan antibodi sekunder dengan banyak enzim sehingga amplifikasi biotin-avidin yang tidak perlu dapat eliminasi serta substrat dapat ditambahkan setelah antibodi sekunder.

Pengujian ELISPOT dapat dilakukan pada jenis sampel berikut:

• Sel mononuklear darah tepi (PBMC)
• Limfosit infiltrasi tumor (TIL)
• Sel dari nodus limfatikus (LN)
• Sel organ limpa (splc)
• Suspensi sel tunggal dari jaringan tertentu
• Sel dari lavage paru-paru
• Cell line yang dikultur (non-adheren dan dalam suspensi) dan klon
• Sel tunggal dalam suspensi

Faktor-faktor utama berhubungan dengan sampel ELISPOT sebagai berikut:

1. Viabilitas hidup sel
2. Tingkatan apoptosis pada populasi sel
3. Tingkat kontaminasi dengan sel-sel “non-target”.
4. Keadaan fungsional sel
5. Adanya co-stimulasi
6. Densitas sel
7. Efektivitas kehadiran antigen
8. Kontaminasi debris sel dan jaringan

ELISPOT Kits dari DAKEWE

• Human ELISPOT Kits – DEKEWE

• Mouse ELISPOT Kit – DAKEWE

• ELISPOT Auxiliary Reagent – DAKEWE

Fluorospot

Pengujian Fluorospot dengan sistem deteksi menggunakan fluorofor dimana prosedur  pengujian serupa dengan ELISPOT enzimatik dual-color atau multiple color. Dua atau tiga antibodi penangkap afinitas terhadap analit berbeda dapat digunakan untuk coating, kemudian sel diinkubasi dan lalu dihilangkan untuk mendeteksi analit. Deteksi bintik dapat dihasilkan oleh antibodi pendeteksi terkonjugasi fluorokrom. Pewarna fluoresen yang paling umum digunakan secara berurutan yaitu FITC, Cy3, Cy5, dan DAPI. Persyaratan utama untuk menjalankan uji Fluorospot adalah tersedianya ELISPOT Reader dengan filter untuk setiap fluorokrom. Instrumentasi ini cenderung lebih mahal dibandingkan Reader biasa sehingga penggunaan Flurospot masih tantangan bagi laboratorium..

Referensi:

1. Hosseini, S.; Vázquez-Villegas, P.; Rito-Palomares, M.; Martinez-Chapa, S.O. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) from A To Z; Springer Nature: Singapore, 2018.
2. Kalyuzhny, A.E. Handbook Of Elispot: Methods and Protocol. Humana Press, 2024.
3. Janetzki, S. Elispot for Rookies (and Experts Too). Springer International Publishing, 2016.