Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) merupakan teknik laboratorium yang banyak digunakan dalam penelitian dan aktivitas klinis untuk mengukur protein target tertentu dalam matriks biologis. Prinsip teknik ELISA bergantung pada prinsip interaksi spesifik antara antigen dan antibodi.

Prosedur ELISA Umum

ELISA dapat dilakukan pada plate polistiren 96-well atau 384-well. Teknik ini bergantung pada dua elemen penting:

• Interaksi spesifik antara antigen dan antibodi. Fidelitas pengikatan yang tinggi antara antigen dan antibodi memungkinkan komponen yang tidak terikat untuk dicuci dari sumuran, sehingga mengurangi background noise. Variabilitas antara batch produksi antibodi juga dapat menghasilkan variasi hasil pengujian, yang merupakan potensi kelemahan ELISA.
• Sifat biologis well-plate yang digunakan. Plate mikrotiter polistiren yang membentuk ikatan stabil dengan antigen atau antibodi (dalam proses pre-coating) tanpa adanya interferensi merupakan jenis plate umumnya digunakan dalam ELISA.

Langkah-langkah singkat teknik ELISA:

1. deteksi antigen target menggunakan antibodi primer yang berikatan dengan antigen;
2. antibodi sekunder terkonjugasi enzim yang mengikat antibodi primer; dan
3. substrat dihidrolisis, hasil produk menginduksi sinyal emisi yang dideteksi oleh komponen-komponen berikut yang dapat menunjukkan keberadaan protein target:
4. perubahan unit cahaya relatif (relative light units, RLU) menggunakan luminometer
5. perubahan densitas optik (optical density, OD) menggunakan spektrofotometer
6. pengamatan visual produk yang diendapkan

Sandwich ELISA dan Kompetitif

Saat ini, terdapat berbagai jenis teknik ELISA yang dapat digunakan tergantung pada kebutuhan spesifik. Teknik-teknik tersebut adalah ELISA direct, indirect, sandwich, dan kompetitif. Pada kesempatan ini kita akan mengulas informasi dan prinsip-prinsip ELISA sandwich dan kompetitif.

ELISA Sandwich

Antibodi capture target dilapisi (pre-coated) pada setiap sumuran well plate-96 dan plate yang dilapisi kemudian dapat digunakan untuk sandwich ELISA. Sebelum menguji standar atau sampel, sumuran harus dicuci dengan washing buffer dan diblokir dengan blocking agent. Larutan blocking buffer dapat dipreparasi dengan menambahkan BSA (bovine serum albumin), serum, dan non-fat dry milk untuk mencegah pengikatan nonspesifik dari standar atau sampel yang ditambahkan pada langkah berikutnya. Langkah pencucian harus dilakukan di antara setiap langkah penambahan reagen.

Standar atau sampel dengan konsentrasi yang diketahui ditambahkan ke setiap sumuran dan diinkubasi selama waktu tertentu (sesuai protokol) untuk memungkinkan antigen target (dalam standar atau sampel) mengikat antibodi capture. Dalam teknik sandwich, antigen perlu memiliki setidaknya dua situs antigenik untuk pembentukan “sandwich”. Setiap antigen yang tidak terikat di sumur akan tercuci selama langkah pencucian. Antibodi deteksi terkonjugasi enzim ditambahkan untuk melengkapi pembentukan “sandwich”, diikuti oleh langkah pencucian dan penambahan substrat yang kemudian mengalami hidrolisis enzimatik.

Substrat chemiluminescent kemudian ditambahkan dan dihidrolisis secara enzimatik oleh HRP, dan produk yang dihasilkan diukur dalam RLU menggunakan luminometer. Cara lain adalah dengan menambahkan larutan blotting dimana setelah dihidrolisis secara enzimatik oleh HRP akan mengendap dan produk terendap dapat diuji dengan analisis kolorimetri (OD) atau secara mikroskopis (diikuti oleh ImageJ). Analisis RLU, OD atau ImageJ pada sampel dapat dibandingkan dengan kurva standar yang diperoleh.

Bergantung pada jenis antibodi dideteksi, sandwich ELISA diklasifikasikan sebagai berikut:

1. ELISA direct-sandwich menggunakan antibodi capture (pada plate) dan antibodi deteksi yang sama, namun antibodi deteksi harus berlabel enzim atau terbiotinilasi untuk membentuk “sandwich” kompleks.
2. ELISA indirect-sandwich melibatkan tiga antibodi: satu antibodi capture yang digunakan untuk melapisi plate dan menangkap antigen, satu lainnya yaitu antibodi deteksi untuk mengikat situs antigenik (untuk kompleks “sandwich”), serta antibodi ketiga (antibodi sekunder) anti-spesies berlabel HRP terhadap antibodi deteksi. Antibodi sekunder berlabel enzim harus berasal dari spesies lain untuk mencegahnya mengikat antibodi capture.

Keunggulan Sandwich ELISA:

• Berbeda dengan ELISA direct atau indirect, metode imobilisasi antibodi bersifat spesifik terhadap antigen sampel. Ketika matriks biologis (serum, plasma, CSF, dll.) merupakan sumber sampel, antigen sampel akan secara spesifik berikatan dengan antibodi capture yang menempel pada sumuran plate.
• Pelapisan (coating) dengan antibodi capture murni terhadap antigen target dapat menghilangkan antigen non-target dalam matriks biologis, sehingga menjadikan ELISA bersifat sederhana, sensitif, dan spesifik.
• ELISA sandwich sangat berguna ketika jumlah antigen dalam konsentrasi rendah atau ketika antigen terkontaminasi dengan antigen/protein nonspesifik lainnya.
• Layaknya ELISA indirect, amplifikasi sinyal dapat diperoleh karena antibodi sekunder digunakan. Hal ini dapat menghasilkan sensitivitas pengujian yang lebih tinggi daripada ELISA direct.

Kelemahan ELISA Sandwich:

1. Reaksi silang (cross-reactivity) antibodi sekunder mungkin terjadi karena teknik ini melibatkan lebih dari satu antibodi (antibodi capture, antibodi deteksi dan bahkan antibodi sekunder).
2. Antigen harus memiliki sekurangnya dua situs antigen, satu untuk antibodi penangkap dan satu untuk antibodi deteksi.
3. Pada direct-sandwich, metode ini hanya dapat digunakan ketika antiserum spesies tunggal tersedia dan ketika antigen tidak terikat plate.
4. Pada indirect-sandwich, metode ini juga memerlukan antibodi konjugat berlabel enzim dari spesies lain untuk mencegah pengikatan dengan antibodi capture.
5. Lebih sederhana tetapi lebih lambat daripada teknik ELISA langsung karena melibatkan langkah penambahan antibodi dua kali atau lebih. Lebih rentan terhadap error personil karena memiliki langkah kerja yang lebih banyak.

ELISA Kompetitif

ELISA kompetitif dicirikan oleh kompetisi antara antigen yang dilapisi (imobilisasi) pada plate dengan campuran antigen sampel-antibodi primer yang ditambahkan ke sumuran yang sama. ELISA kompetitif dapat dirancang tergantung pada apakah analitnya berupa antigen atau antibodi. Ada beberapa subtipe ELISA kompetitif versi modifikasi, namun kita hanya akan membahas empat subtipe pada kesempatan ini:

● ELISA direct–kompetisi antigen
Kompetisi untuk antigen imobil terjadi setelah penambahan campuran pra-titrasi antigen sampel dan antibodi terkonjugasi enzim (atau terbiotinilasi). Antigen sampel yang ditambahkan bersaing dengan antigen imobil pada plate untuk berikatan dengan antibodi.

● ELISA direct–kompetisi antibodi
Kompetisi untuk pengikatan antibodi terkonjugasi enzim pra-titrasi ke antigen imobil terjadi setelah penambahan sampel serum/plasma yang mengandung antibodi spesifik. Antibodi sampel yang ditambahkan bersaing dengan antibodi deteksi terkonjugasi enzim pra-titrasi untuk mengikat antigen imobil.

● ELISA indirect–kompetisi antigen
Dalam metode ini, kompetisi untuk antigen terjadi ketika campuran sampel pra-titrasi (yang memiliki situs pengikatan antigen sama dengan antigen imobil) ditambahkan bersamaan dengan antibodi primer spesifik antigen imobil. Antigen sampel bersaing dengan antigen imobil, dan deteksi terjadi setelah penambahan antibodi terkonjugasi enzim atau terbiotinilasi.

● ELISA indirect–kompetisi antibodi

Dalam metode ini, kompetisi muncul untuk antibodi primer pra-titrasi yang mengikat antigen imobil ketika sampel serum/plasma mengandung antibodi dari spesies berbeda dimasukkan. Antibodi sampel yang ditambahkan bersaing dengan antibodi primer untuk menempel pada antigen imobil. Deteksi terjadi dengan penambahan antibodi berlabel khusus spesies atau antibodi deteksi terkonjugasi enzim.

ELISA kompetitif melibatkan penambahan premix antigen sampel dan antibodi konjugasi HRP atau biotin, atau penambahan premix antigen sampel dan antibodi primer non-label, ke antigen imobil (pre-coated). Langkah-langkah pencucian harus dilakukan di antara setiap langkah penambahan reagen. Kompetisi terjadi antara antigen imobil dan antigen sampel untuk mengikat antibodi. Antibodi dan antigen sampel yang tidak terikat akan dicuci. Proses ini diikuti oleh penambahan S-HRP jika antibodi terbiotinilasi digunakan dalam premix.

Keunggulan ELISA Kompetitif:

1. Metode kompetitif antara antigen sampel versus antigen-antibodi imobil bersifat spesifik untuk antigen sampel target. Ketika matriks biologis (serum, plasma, atau CSF) digunakan sebagai sumber sampel, antigen sampel dapat secara spesifik bersaing dengan antibodi capture imobil.

Kelemahan ELISA Kompetitif:

1. Persaingan antara antigen sampel dan antigen imobil mungkin tidak spesifik. Bila matriks biologis (serum, plasma, atau CSF) digunakan sebagai sumber sampel, beberapa protein kontaminan atau nonspesifik (yang berlimpah) dalam matriks sampel dapat bersaing dengan antigen atau antibodi mobil dalam sumuran plate.

Referensi:

1. John R. Crowther. 2009. The ELISA Guidebook. Humana Press. Springer.
2. Robert Hnasko. 2015. ELISA: Methods and Protocols. Humana Press. Springer.
3. Samira Hosseini, Patricia Vázquez-Villegas, Marco Rito-Palomares, Sergio O. Martinez-Chapa. 2017. Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA): From A to Z. Springer.
4. Robert Matson. 2023. ELISA: Methods and Protocols. Humana Press. Springer.
5. David Wild. 2013. The Immunoassay Handbook. Theory and Applications of Ligand Binding, ELISA and Related Techniques. Elsevier.