Seorang peneliti di bidang molekular pasti tidak asing dengan istilah Western Blot. Western Blotting adalah teknik yang sudah banyak digunakan di bidang biologi molekuler untuk mendeteksi protein spesifik dari campuran kompleks protein yang diekstraksi dari jaringan atau sel. Antibodi sintetis atau antibodi yang berasal dari hewan, dibuat bereaksi dengan protein target tertentu. 

Metode blotting lain yang biasa dikenal yaitu Southern blotting dan Northern blotting. Perbedaan utama ketiga metode ini adalah makromolekul yang dideteksi. Southern blotting mengidentifikasi urutan DNA spesifik, sedangkan Northern blotting mengidentifikasi urutan RNA spesifik dan Western blotting mengidentifikasi urutan protein spesifik dalam sampel. Selain itu Southern blotting melibatkan elektroforesis gel Agarose, sedangkan Northern blotting melibatkan denaturasi gel agarose formaldehida dan Western blotting melibatkan SDS PAGE. Berkaitan dengan metode blottingnya, baik Southern dan Northern blotting melibatkan transfer kapiler sementara Western blotting melibatkan transfer listrik. Southern blotting menggunakan probe DNA sedangkan Northern blotting menggunakan probe cDNA dan Western blotting menggunakan antibodi primer dan sekunder.

Persiapan Sampel

Sebelum masuk tahap western blotting hal pertama yang harus dilakukan adalah persiapan sampel. Persiapan sampel diawali dengan ekstraksi protein. Untuk tahap ini beberapa reagen yang bisa digunakan dari Solarbio Life Science yaitu:

Setelah proses ekstraksi, perlu dilakukan pengukuran konsentrasi protein. Kandungan protein akan ditentukan dengan membandingkan absorbansi sampel dengan koefisien absorbsi yang ditentukan dari kurva standar. Kurva standar dibuat dengan memplot absorbansi sampel yang mengandung konsentrasi protein standar yang diketahui. Produk kit berikut dapat digunakan untuk mengukur konsentrasi protein.

Prosedur Western Blot

• Elektroforesis

Tahap pertama western blot adalah elektroforesis yang memisahkan jenis protein. Gel yang umum digunakan yaitu SDS PAGE. Preparasi gel SDS PAGE dilakukan dengan mencampurkan buffer, Acrylamide, Ammonium Persulfate, dan TEMED. Untuk mempersingkat proses dan mempermudah pengerjaan metode Western Blot ini, Biosolar Life Science menyediakan pre-cast gel sehingga peneliti dapat langsung menjalankan proses elektroforesis. Berikut beberapa produk pre-cast gel yang dapat digunakan:

Setelah gel siap, kemudian sampel  ditambahkan dan gel dialiri listrik. Protein yang memiliki berat molekul yang kecil akan bergerak lebih cepat dibandingkan protein yang memiliki berat molekul lebih tinggi.

• Transfer Protein

Setelah memisahkan protein dengan elektroforesis, protein dipindahkan dari dalam gel ke membran padat agar protein dapat diakses untuk deteksi antibodi. Metode utama untuk mentransfer protein disebut electroblotting, yang menggunakan medan listrik tegak lurus pada permukaan gel untuk menarik protein keluar dari gel dan pindah ke membran. Berikut beberapa rekomendasi produk yang dapat membantu dalam proses transfer protein.

• Blocking

Blocking adalah langkah penting dalam western blot untuk mencegah antibodi mengikat membran secara non-spesifik. Penghambat yang paling umum digunakan adalah BSA dan non-fat dry milk. Ketika membran ditempatkan dalam larutan encer protein, protein menempel ke semua tempat di membran di mana protein target belum menempel. Dengan cara ini, “noise” pada produk akhir western blot dapat dikurangi dan menghasilkan hasil yang lebih jelas.

• Inkubasi Antibodi

Setelah blocking, antibodi primer mengikat protein target ketika antibodi primer diinkubasi dengan membran. Pilihan antibodi primer tergantung pada antigen yang akan dideteksi. Membran kemudian dicuci dengan larutan buffer antibodi untuk menghilangkan antibodi yang tidak terikat. Langkah selanjutnya yaitu menambahkan antibody sekunder dan Kembali melakukan inkubasi. Saat inkubasi, antibodi sekunder berlabel dapat berikatan dengan antibodi primer yang telah bereaksi dengan protein target.

• Deteksi

Substrat bereaksi dengan enzim yang terikat pada antibodi sekunder untuk menghasilkan zat berwarna. Ini memungkinkan kita untuk mengetahui masa jenis dan lokasi protein target. Dan perkiraan ukuran diambil dengan membandingkan pita protein dengan marker. Ada beberapa sistem deteksi yang tersedia untuk visualisasi protein, seperti deteksi kolorimetri, deteksi chemiluminescent, deteksi radioaktif, dan deteksi fluoresen. Sistem yang paling umum digunakan adalah DAB (diaminobenzidine) dan ECL (Enhanced chemiluminescence). DAB memiliki kelebihan yaitu mudah digunakan dan cocok untuk mendeteksi sampel dengan tingkat rekombinasi protein yang tinggi. Beberapa kit detesi DAB yang banyak digunakan yaitu:

Meskipun DAB mudah dalam penggunaan namun DAB tidak terlalu sensitive. Kit dngan sistem ECL 10 kali lebih sensitif dibandingkan DAB dan cocok digunakna untuk deteksi protein pada jaringan dan sel. Berikut rekomendasi kit menggunakan sistem ECL.

Referensi

Mahmood T, Yang P C. Western blot: technique, theory, and trouble shooting. North American journal of medical sciences, 2012, 4(9): 429.