A. Pengantar Materi Imaging & Luminex

Imaging atau dikenal juga dengan pencitraan merupakan proses untuk menghasilkan gambar secara spesifik melalui layar. Imaging berperan penting dalam dunia kedokteran, antara lain untuk prediksi, screening, biopsy guidance, diagnosa & staging, prognosis, therapy planning, therapy guidance, serta evaluasi terapi. Terdapat beberapa teknik imaging yang dapat dilakukan khususnya pada hewan coba. Berikut merupakan tabel teknik imaging pada hewan coba.

Tabel 1. Teknik Imaging pada Hewan Coba

Hewan coba dalam penelitian kanker memiliki peran penting, yaitu untuk memahami biologi kanker, uji praklinis obat, pengembangan terapi baru, sebagai jembatan penelitian dasar dengan klinis, serta sebagai pertimbangan etis. Hewan coba yang sering digunakan adalah mencit atau tikus. Sekitar > 95% hewan coba tersebut digunakan untuk mempelajari mekanisme kanker in vivo. Studi kanker praklinis dengan hewan coba akan menggunakan model tumor dengan 2 jenis pemberian model. Model tumor pertama menggunakan transplantasi sel tumor pada hewan coba. Model tumor kedua dengan memunculkan tumor atau diinduksi dalam inangnya. Berikut merupakan beberapa model tumor yang dapat digunakan dalam riset:

1. Model tumor spontan

Menggunakan hewan coba dengan insiden kanker alami. Contoh model yang dapat digunakan adalah mencit (inbred strains): leukimia, kanker payudara, adenoma paru, dan hepatoma.

2. Model tumor yang diinduksi virus

• Friend leukemia (in Swiss mice) ditransmisikan melalui cell-free spleen homogenate filtrates.
• Rous sarcoma (in young chicks) ditransmisikan melalui tumor fragment implantation / cell-free tumour homogenates.

3. Tumor yang disebabkan oleh radiasi

Radiasi UV merupakan karsinogen yang terbukti digunakan untuk menginduksi kanker pada hewan coba. Terkadang dikombinasi dengan agen kimia seperti TPA atau DMBA.

4. Tumor yang diinduksi secara kimia

Tumor yang diinduksi secara kimia muncul dari sel inang. Contoh bahan kimia yang digunakan antara lain:

• DMBA : mammary tumours (rats)
• DMAB : colon tumours
• 3,4,9,10-dibenzopyrene : fibrosarcoma (mice)
• 3,4-benzopyrene : spindle cell sarcomas
• 20-methylcholanthrene : leukaemia & sarcomas

5. Tumor yang dapat ditransplantasikan

Menggunakan cancer cell line atau jaringan yang ditumbuhkan pada hewan coba. Terdapat 2 metode transplantasi, yaitu:

• Heterotopik
  Tumor ditransplantasikan di lokasi yang bukan lokasi asal. Hasil transplantasi akan membentuk asites atau tumor padat.
• Ortotopik
  Sel tumor ditransplantasikan ke lokasi anatomi aslinya.

6. Model singenik

Menggunakan cancer cell line/jaringan mencit atau tikus yang ditransplantasikan ke hewan inbred dengan latar belakang genetik yang sama.

7. Model xenograft

Menggunakan model tumor transplantasi asal manusia yang sangat mirip dengan kanker klinis. Metode transplantasi yang digunakan yaitu, inokulasi subkutan, intraperitoneal, intravena, intrakranial, intrasplenik, subkapsular ginjal, atau ortotopik (spesifik lokasi).

Keberhasilan pembuatan hewan model kanker perlu diikuti dengan metode analitik yang akurat untuk mendeteksi dan mengukur biomarker spesifik, di mana immunoassay menjadi salah satu teknik yang paling banyak digunakan. Immunoassay merupakan uji biokimia yang menggunakan ikatan antigen antibodi untuk mendeteksi dan menghitung molekul spesifik (protein, hormon, sitokinin, dan patogen). Metode yang digunakan dalam immunoassay antara lain ELISA, Western Blot, dan Luminex. Pada artikel kali in pembahasan akan lebih terfokus pada luminex. Uji luminex merupakan uji imunologi berbasis partikel magnetik yang menggunakan prinsip sandwich yang sama dengan ELISA tradisional. Metode ini memungkinkan peneliti untuk mengukur hingga 100 biomarker dengan volume sampel yang lebih sedikit dibandingkan ELISA berbasis plate tradisional. Mikrosfer berwarna atau butiran diwarnai secara internal dengan proporsi berbeda dari fluorofor merah dan inframerah yang sesuai dengan tand spektral.

Pelatihan didampingi oleh drh. Oktaria Kusuma Dewi dan Bapak Agung Febriyanto, A.Md dalam pembuatan hewan model serta imaging capture with Vevo F2 di Gedung B LPPT UGM. Pelatihan preparasi sampel dan pembacaan luminex didampingi oleh Bapak Taufik Indramawan dan Kak Dela.

B. Alat dan Bahan Pembuatan Hewan Model Kanker Payudara serta Imaging Capture with Vevo F2

• Spuit
• Sonde oral
• Anestesi
• Plester
• DMBA
• Corn oil
• Vevo F2
• Hair removal body cream
• Cotton swab steril
• Ultrasonic gel

C. Alat dan Bahan Preparasi Sampel dan Pembacaan Luminex

• Adjustable pipettes (25 – 1000µL)
• Multichannel pipettes (5 – 50µL atau 25 – 200µL)
• Reagent reservoirs
• Polypropylene microfugetubes
• Rubber bands
• Aluminium foil
• Absorbent pads
• Vortex
• Sonicator
• Titer plate shaker
• Luminex
• Automatic plate washer for magnetic beads atau handheld magnet
• Mouse Angiogenesis/Growth Factor Magnetic Bead Panel
• Timer
• Kulkas 4°C

D. Pembuatan Hewan Model serta Imaging Capture with Vevo F2

1. Ambil hewan coba (mencit) yang akan digunakan sebagai hewan model.
2. Anestesi hewan coba dengan dosis 0.1/100 gram berat badan.
3. Tunggu hingga obat anestesi bekerja.
4. Taruh hewan coba yang sudah terbius dengan posisi telentang.
5. Injeksikan bahan kimia (DMBA) sebagai model tumor payudara. Namun, saat pelatihan hanya menggunakan pelarutnya saja yaitu corn oil.
6. Injeksi dengan cara subkutan, dimana hewan coba sedikit dicubit pada bagian paha bawah dan injeksikan secara perlahan dan hindari penyuntikan ke arah abdomen. Penyuntikan dilakukan secara hati-hati agar terhindar dari kebocoran yang mengakibatkan dosis yang diberikan tidak tepat.
   
7. Pijat secara perlahan bagian tubuh yang disuntik.
   
8. Observasi secara berkala untuk melihat perkembangan apakah hewan model tumor payudara berhasil atau tidak.
9. Hewan model yang sudah berhasil dapat diobservasi menggunakan Vevo F2
10. Anestesi hewan coba dengan dosis yang sama dan tunggu hingga anestesi bekerja dalam tubuh.
11. Hilangan rambut hewan model pada bagian abdomen menggunakan hair removal body cream
    
12. Siapkan gel pada meja preparat alat USG. Taruh hewan model dengan posisi telentang dan plester bagian kaki dan ekor.
13. Berikan ultrasonic gel pada bagian abdomen.
    
14. Hewan coba siap diobservasi menggunakan Vevo F2.
    

E. Sampel Serum Mencit yang Telah Diinduksi Kanker Payudara

1. Biarkan darah menggumpal selama 30 menit sebelum sentrifugasi selama 10 menit dengan kecepatan 1000xg. Ambil serum dan lakukan pengujian dengan segera atau bagi sampel menjadi aliquot dan simpan pada suhu ≤ 20°C.
2. Hindari freeze/thaw cycles (> 2).
3. Saat menggunakan sampel beku, direkomendasikan untuk mencairkan sampel sepenuhnya. Campurkan dengan vortex dan sentrifugasi sebelum diuji untuk menghilangkan partikel.
4. Sampel serum dilarutkan dalam Assay Buffer dalam kit dengan perbandingan 1 : 2.

F. Prosedur Immunoassay

1. Tambahkan 200µL assay buffer dalam setiap sumuran plate. Tutup dengan sealer dan campur menggunakan plate shaker selama 10 menit pada suhu ruang (20-25°C).
2. Buang assay buffer dan sisa cairan dari semua sumuran dengan cara membalik plate yang telah dipasang plate washer for magnetic beads.
3. Tambahkan 25µL setiap standard atau kontrol ke sumuran. Assay buffer digunakan untuk standard 0 pg/mL.
4. Tambahkan 25µL assay buffer ke sumuran sampel.
5. Tambahkan 25µL dalam sumuran matrix yang sesuai sebagai background, standard, dan kontrol. Saat sampel yang diuji menggunakan serum atau plasma gunakan serum matrix. Saat sampel yang diuji jaringan atau supernatant lain, gunakan kontrol kultur medium yang sesuai sebagai matrix solution.
6. Tambahkan 25µL sampel ke sumuran yang sesuai.
7. Vortex Mixed Beads dan tambahkan 25µL ke setiap sumuran.
8. Inkubasi semalaman (16-20 jam) pada suhu 2-8°C.
9. Cuci sebanyak 3 kali dengan 200µL Wash Buffer.
   
10. Tambahkan 25µL Detection Antibodies pada setiap sumuran.
11. Inkubasi selama 1 jam di suhu ruang.
    
12. Tambahkan 25µL Streptavidin-Phycoerythrin pada setiap sumuran.
13. Inkubasi selama 30 menit di suhu ruang.
14. Cuci sebanyak 3 kali dengan 200µL Wash Buffer.
15. Tambahkan 150µL Sheath Fluid atau Drive Fluid setiap sumuran.
16. Baca pada alat Luminex (100µL, 50 beads per bead set).
    

G. Running Luminex

1. Nyalakan komputer lalu buka software Luminex.
2. Klik “Protocols” dan klik “Protocols” kembali.
3. Klik “Create new protocol”. Beri nama protocol. Isi bagian manufacturer (sesuai dengan kit yang digunakan). Isikan volume dengan “sample size” (100µL). Bead type berupa “MagPlex”. (Pilihan MicroPlex dapat digunakan untuk running berupa DNA/RNA). XY Heater diabaikan. Time out diisi “60s”. DD Gating diisi “8000 – 15000”. Analysis type pilih “kuantitatif”. Use External Analysis Program checklist. Number of Standards “7” (sesuaikan dengan standar yang dibuat). Klik “Next”.
4. Klik marker sesuai dengan angka pada beads yang terdapat di manual.
5. Beri nama pada angka beads sesuai dengan marker.
6. Unit diisi dengan pg/mL (disesuaikan pada manual kit).
7. Count diisi “50”. Lalu klik “Apply All”. Klik “Next”.
8. Tentukan plate map sesuai dengan mapping sampel di well plate.
9. Apabila terdapat ulangan pada sampel silahkan klik “replicate”. Klik “save”.
10. Klik “Batch”. Pilih protokol yang baru saja dibuat. Klik “next”.
11. Plot number diisi sesuai dengan kit yang digunakan. ED dibuat sesuai kit yang digunakan mm/dd/yy. Masukkan standar tertinggi pada masing-masing marker. Perbandingan ditulis 1:3 (didapatkan dari standar tertinggi dibagi dengan standar dibawahnya). Klik “apply delution”. Klik “Next”. Klik “Run”.