Mulai dari kultur monolayer dasar hingga intervensi kanker berbasis sel terkini, kultur sel 2D masih berperan penting dalam diagnosis, prognosis, dan pengobatan kanker. Berbagai metodologi 2D dikembangkan dalam diagnosis kanker, antara lain berbagai tes laboratorium dan pencitraan, biopsi cair, smear, dan skrining DNA yang akan dibahas kali ini.

1. Kultur Sel Dua Dimensi (2D) dalam Diagnosis Kanker

Teknik kultur sel 2D (2-dimensi) atau teknik kultur sel pada bidang datar merupakan metode kultur yang telah dikembangkan sejak puluhan tahun yang lalu dan sampai saat ini tetap menjadi pilihan terbaik meskipun kemajuan teknologi dan metodologi investigasi kanker sudah menjadi pesat. Berikut beberapa pengujian laboratorium menggunakan kultur 2D dalam diagnosis kanker:

a. Biopsi Cair / Analisis Darah

Sehubungan dengan metodologi berbasis sel 2D dalam diagnosis kanker, salah satu metodologi yang paling populer adalah pengamatan CTC (circulating tumor cells). Pengujian CTC digunakan untuk monitoring kanker payudara, prostat, dan kolorektal metastatik dengan prinsip dikarenakan bahwa sel kanker lepas dari tumor padat dan masuk ke sirkulasi darah. Dalam aliran darah, CTC dapat diambil, diidentifikasi dan dihitung. Ekstraksi CTC dari darah digunakan untuk analisis DNA/RNA pada chip microwell 2D, menggunakan staining DAPI, CD45-APC, CD16, dan CK-PE. Uji CTC sering digunakan sebelum memulai terapi atau dilakukan selama pengobatan. Selain CTC, metodologi slide 2D berbasis darah lainnya yaitunya CBC (complete blood counts) yang umum dilakukan di laboratorium diagnostik.

b. Pencitraan dan Histologi

Histologi masih dianggap sebagai metode “gold standard” dalam diagnosis klinis kanker serta hampir selalu digunakan deteksi dan grading kanker payudara, prostat, serviks dan paru-paru. Jenis histologis ditentukan dengan memeriksa jaringan dicurigai yang dieksisi melalui biopsi atau pembedahan. Jika jaringan tampak beragam dari yang biasanya ditemukan, hal ini dapat mengindikasikan adanya kanker yang mengalami metastasis. Histologi juga dapat mengidentifikasi jenis sel tertentu, misalnya perbedaan antara berbagai kanker kulit seperti melanoma, karsinoma sel basal, dan karsinoma sel skuamosa.

Staining histologis yang paling umum dalam pengamatan jaringan adalah hematoksilin dan eosin (H&E), dimana hematoksilin nukleus dengan warna biru tua dan eosin mewarnai organel sitoplasma dengan warna pink atau merah. Staining khusus juga tersedia untuk jaringan tertentu, seperti Masson’s trichrome (serat kolagen, warna biru) dan Prussian blue stain (identifikasi zat besi dalam tubuh).

c. Biopsi

Biopsi seringkali digunakan dalam diagnosis kanker, dimana sebagian sel diambil melalui pembedahan dari tumor dan kemudian diuji di laboratorium. Tergantung dengan dugaan jenis kanker, beberapa biopsi spesifik dapat dilakukan:

• FNA (fine needle aspiration) : jarum tipis, kecil dan berongga digunakan untuk mengangkat sel dan cairan tumor. CT scan atau USG dapat digunakan untuk memandu jarum apabila tumor sulit untuk dijangkau.
• Biopsi inti (core biopsy) : serupa dengan FNA, namun menggunakan jarum lebih besar.
• Biopsi eksisi (excisional biopsy): selama biopsi eksisi, area dibuat mati rasa, kulit disayat, dan seluruh tumor diangkat.
• Biopsi insisional (incisional biopsy): serupa dengan biopsi eksisi, namun hanya bagian kecil tumor diangkat.
• Biopsi laparoskopi: sayatan kecil dibuat dan laparoskop (alat bedah kecil berkamera) dimasukkan untuk melihat bagian abdomen dan sampel jaringan diambil.
• Biopsi endoskopi: endoskop (tabung tipis, fleksibel berkamera dan lampu pada ujungnya) dimasukkan melalui mulut, hidung, kandung kemih, tenggorokan, atau paru-paru. Alat bedah kecil disisipkan pada tabung dan sampel diambil.
• Biopsi kulit: umumnya digunakan untuk mendiagnosis kanker kulit sel basal atau sel skuamosa. Berbagai jenis biopsi kulit dapat digunakan misalnya, punch biopsy untuk mengangkat sebagian kecil jaringan lapisan kulit (epidermis, dermis, lemak subkutan), shave biopsy untuk mengangkat lapisan kulit paling atas (epidermis, dermis).

d. Sitologi / Apusan (Smear)

Dibandingkan dengan biopsi yang digunakan untuk analisis jaringan, pengujian sitologi ditujukkan untuk mempelajari begaian kecil populasi sel. Morfologi sitologi sel yang dipelajari di bawah mikroskop setelah staining. Sel-sel diambil menggunakan berbagai metode seperti pengikisan permukaan jaringan (pemeriksaan serviks) atau pengumpulan cairan tubuh (lendir). Sampel analisis sitologi umumnya lebih mudah diperoleh dan memiliki kemungkinan rendah terjadinya komplikasi dengan sedikit ketidaknyamanan. Selain itu, sitologi juga dengan biaya relatif lebih murah dan juga dapat digunakan untuk skrining.

e. Skrining DNA/RNA dan Uji Genetik

Skrining DNA dan pengujian genetik dapat membantu memprediksi probabilitas munculnya kanker dengan metode pencarian perubahan genetik spesifik seperti mutasi pada  kromosom, gen, atau protein. Pengujian ini juga memberikan informasi terkait mutasi tertentu yang memiliki risiko pewarisan ke keturunan selain dapat menunjukkan informasi kesehatan pasien secara keseluruhan. Skrining DNA banyak digunakan untuk kanker ovarium, payudara, prostat, pankreas, usus besar, tiroid, ginjal, lambung, sarkoma dan melanoma. Uji genetik sangat berguna bagi pasien yang mempunyai risiko kanker herediter.

2. Kultur Sel Dua Dimensi (2D) dalam Prognosis Kanker

Selain dari segi diagnosis kanker, kultur sel 2D juga berperan penting dalam menentukan prognosis setelah diagnosis kanker. Metode yang paling umum digunakan untuk prognosis kanker  yaitu profilisasi tumor (tumor profiling). Profil tumor terdiri dari berbagai pengujian untuk memeriksa gen, mutasi gen, biomarker dan protein dalam sampel jaringan tumor. Pembuatan profil tumor adalah alat yang sangat bermanfaat dalam personalisasi pengobatan karena dapat membantu merencanakan pengobatan kanker, serta memprediksi metastasis dan kambuhnya.

Saat ini, profil tumor digunakan untuk menentukan apakah jalur perkembangan tumor sesuai dengan target pengobatan yang tersedia, khususnya pada kanker paru-paru, kolorektal, sarkoma dan melanoma, dimana kanker-kanker tersebut lebih sering dikaitkan dengan mutasi genetik. Meskipun terbilang handal, profil tumor juga memiliki keterbatasan diantaranya:

• hanya sebagian kecil gen yang telah diprofilisasikan;
• tidak ada jaminan bahwa tumor akan merespons pengobatan;
• hasil dapat bersifat sementara meskipun merespon pengobatan; serta,
• tahun berbeda dapat memberikan hasil berbeda dikarenakan kanker bersifat dinamis.

3. Kultur Sel Dua Dimensi (2D) dalam Skrining Obat dan Penelitian Biomedis

a. Clonogenic Assay

Clonogenic assay (colony formation assay) merupakan pengujian kelangsungan hidup sel in vitro berdasarkan kemampuan sel tunggal untuk membentuk koloni minimal terdiri dari 50 sel. Clonogenic assay menguji kemampuan populasi sel untuk melakukan pembelahan “tanpa batas”. Pengujian ini banyak digunakan untuk mendeterminasi kematian reproduksi sel setelah pengobatan radioterapi serta menentukan efektivitas berbagai agen, temasuk obat sitotoksik, nanomaterial dan gen.

b. Cell Proliferation / Cytotoxicity Assay

Cell proliferation dan cytotoxicity assay digunakan untuk menentukan viabilitas sel terhadap berbagai paparan kondisi tertentu. Viabilitas sel didefinisikan sebagai jumlah sel sehat dalam suatu sampel. Cell proliferation assay biasanya mendeteksi perubahan populasi sel atau perubahan pada jumlah pembelahan sel yang dapat dibagi menjadi beberapa metodologi:

• metabolic/enzyme activity assay
• cell membrane permeability assay
• cell proliferation marker assay
• ATP quantification assay
• cell adherence assay
• DNA synthesis assay

a) Metabolic/enzyme activity assay

1) MTT assay

MTT assay adalah pengujian kolorimetri yang menilai aktivitas metabolisme sel berdasarkan konversi MTT ((3-[4,5-dimethylthiazol2-yl]-2,5 diphenyl tetrazolium bromide) menjadi kristal formazan non-larut, menggunakan bantuan enzim oksidoreduktase bergantung-NADPH mitokondria yang dilepaskan dalam sel hidup. MTT assay memungkinkan untuk menentukan jumlah sel viabel dengan mengukur aktivitas mitokondria yang sebanding dengan jumlah kristal formazan yang terbentuk. MTT assay paling sering digunakan untuk mendeteksi sitotoksisitas senyawa obat dalam berbagai kondisi dan konsentrasi, menentukan nilai IC₅₀ dalam assessment praklinis in vitro untuk memprediksi dosis sebelum eksperimen in vivo, serta dalam studi resistensi obat cell line.

2) LDH assay

LDH (laktat dehidrogenase) assay merupakan pengujian penentuan sitotoksisitas sel melalui pelepasan enzim sitoplasma LDH ke dalam media kultur sel setelah gangguan membran pada sel yang rusak dan hampir mati. Jumlah formazan yang dihasilkan berbanding lurus dengan jumlah LDH yang dilepaskan dalam media. LDH assay banyak digunakan karena mudah dan cepat. Keterbatas teknik ini yaitu kemungkinan media kultur terkontaminasi oleh aktivitas LDH endogen dari sel viabel sehingga dapat menyebabkan hasil positif palsu dan merusak integritas eksperimen.

3) Alamar blue assay

Alamar blue assay atau Resazurin assay adalah pengujian yang menentukan jumlah sel berproliferasi. Dye staining ini bersifat nontoksik saat memasuki sel yang kemudian direduksi menjadi resorufin (fluoresensi merah dalam sitosol). Pada sel yang berproliferasi, laju konversi resazurin menjadi resorufin lebih tinggi dibandingkan sel hampir mati atau telah mati. Metode ini lebih digemari karena toksisitas lebih sedikit dibandingkan metode lainnya. Dye resazurin juga dapat digunakan dalam assessment sitotoksisitas kronis dimana untuk melakukan eksperimen jangka panjang karena sifatnya tidak membunuh sel. Selain itu, karena sifatnya tidak larut air, non-radioaktif, dan stabil menjadikan resazurin ideal untuk kultur sel. Meskipun demikian, assay ini juga seringkali dioptimasi saat menggunakannya sehingga terdapat keterbatasan penerapannya untuk pengujian cepat, serta interferensi selama pembacaan fluoresensi yang menyebabkan hasil palsu.

b) ATP quantification assay

ATP quantification assay atau ATP assay merupakan marker yang sangat berguna untuk mengetahui efek toksik suatu senyawa dengan mengukur total ATP pada sampel. ATP assay didasarkan pada monitoring kadar ATP melalui metode luminescens. Enzim luciferase akan bereaksi dengan ATP di sel untuk menghasilkan cahaya yang dapat diukur dengan Plate Reader Luminescent dimana cahaya berbanding lurus dengan kelangsungan hidup sel. ATP assay memberikan banyak keunggulan dibandingkan format pengujian lainnya karena cepat, mudah, sangat sensitif, hemat biaya dan area penggunaan yang luas. Dikarenakan sinyal endpoint muncul dalam waktu yang berkelanjutan disebabkan stabilitas pengujian, pengukuran juga lebih mudah dilakukan.

c. Membrane integrity: G6PD release & Trypan blue

Marker toksisitas sel lain yaitu keberadaan kerusakan integritas membran sel, dimana dapat diuji dengan dua metode paling umum:  G6PD assay dan Trypan blue exclusion. G6PD assay adalah microplate assay berbasis fluoresensi yang mengukur kematian sel melalui pengukuran aktivitas G6PD (glukosa-6-fosfat dehidrogenase). Trypan blue (blue azo dye) merupakan dye impermeabel terhadap membran sel normal dan hanya dapat memasuki sel dengan membran yang rusak. Setelah masuk ke sel, Trypan blue akan berikatan dengan protein intraseluler untuk menghasilkan warna biru. Trypan blue assay biasanya digunakan untuk mengidentifikasi dan menghitung sel hidup dan mati dalam populasi sel.

d. Adhesion, migration, invasion, wound healing assay

a) Adhesion assay

Adhesi sel merupakan mekanisme rumit yang terlibat dalam banyak proses mulai dari migrasi sel, invasi sel, embriogenesis, remodeling jaringan dan penyembuhan luka. Sel memiliki kemampuan untuk melekat pada berbagai protein di ECM (extracellular matrix), seperti kolagen I dan IV, laminin, fibronektin, dan fibrinogen untuk membentuk kompleks dengan komponen sitoskeletal yang berbeda atau pada epitel dan endotel. Adhesion assay tidak hanya mengukur kontak antara sel dan protein adhesi ekstraseluler tetapi juga memungkinkan memperoleh lebih banyak informasi mengenai berbagai peristiwa dan jalur seluler lainnya.

b) Migration assay dan invasion assay

Migrasi sangat penting untuk perkembangan normal, respon imun, serta proses penyakit termasuk metastasis dan peradangan. Migrasi maupun invasi sel merupakan proses multilangkah sangat kompleks yang berperan penting dalam perkembangan penyakit, termasuk aterosklerosis, artritis dan kanker. Prinsip migrasi sangat penting dalam perkembangan berbagai penyakit, sedangkan prinsip invasi mencakup migrasi sel melalui degradasi ECM dan proteolisis.

Migration assay yang paling dikenal yaitu Boyden Chamber assay yang menggunakan sistem migrasi berbasis transwell menggunakan ruang plastik berongga, dimana salah satu ujung ditutup dengan membran berpori. Migrasi sel dianalisa secara real-time menggunakan mikroskop. Meskipun awalnya bersifat kualitatif, saat ini berbagai perangkat lunak dan program telah dikembangkan untuk memenuhi syarat migrasi sel secara kuantitatif.

Invasion assay mendeterminasi pergerakan sel melintasi EMC dan kemampuan untuk menginvasi jaringan sekitarnya. Meskipun migration assay tidak menggunakan filter, invasion assay menggunakan filter dengan molekul ECM (elastin dan kolagen).

c) Wound healing / Scratch assay

Wound healing assay atau scratch assay in vitro adalah metode mudah dan murah untuk mengukur migrasi sel. Monolayer sel dikultur sebelumnya, kemudian sebagian sel “digaruk/digores (scratched)” dan migrasi sel mendekati garukan diamati secara berkala dengan pengambilan gambar. Scratch assay banyak digunakan untuk mempelajari efek interaksi sel-sel dan matriks-sel terhadap migrasi sel. Pengujian ini juga sangat berguna karena kompatibel dengan pencitraan sel hidup dan kejadian intraseluler dapat dimonitor jika diinginkan. Wound healing assay dapat digunakan untuk menilai migrasi sel tunggal di tepi garukan dan andal karena efisiensi waktu pengujian (beberapa jam hingga semalaman).

d) Angiogenesis

Angiogenesis berhubungan dengan proses pembentukan dan pertumbuhan pembuluh darah, dari suplai darah yang sudah ada sebelumnya yang kemudian mengalami maturasi menjadi pembuluh darah stabil (dapat mensuplai oksigen dan nutrisi). Angiogenesis penting dalam kanker karena tumor padat memerlukan suplai darah untuk tumbuh. Tumor padat mampu membentuk suplai darah sendiri dengan menghasilkan berbagai sinyal kimia untuk merangsang angiogenesis serta merangsang sel-sel normal sekitarnya untuk melepaskan molekul sinyal angiogenik.

Beberapa pengujian angiogenik in vitro berbasis sel 2D tersedia saat ini untuk mempelajari angiogenesis, termasuk angiogenesis tube formation assay, microfluidic based angiogenesis assay, endothelial adhesion assay, invasion assay, migration assay, serta wound healing assay. Salah satu metode yang paling umum dan populer untuk mempelajari migrasi sel dan angiogenesis adalah wound healing assay seperti yang dibahas di atas.

Tabel 1. Produk-produk dalam penelitian, diagnosis dan prognosis kanker.

4. Referensi

1. Hashimoto K, Nishimura S, Ito T, Oka N, Akagi M. Limitations and usefulness of biopsy techniques for the diagnosis of metastatic bone and soft tissue tumors. Ann Med Surg (Lond). 2021 Jul 16;68:102581.
2. Kilic A, Kilic A, Kivanc AE, Sisik A. Biopsy Techniques for Skin Disease and Skin Cancer: A New Approach. J Cutan Aesthet Surg. 2020 Jul-Sep;13(3):251-254.
3. Beard Cj, Ponnarasu S, Schmieder GJ. Excisional Biopsy. [Updated 2022 Aug 29]. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2024 Jan-.
4. Ramsey ML, Rostami S. Skin Biopsy. [Updated 2023 Sep 4]. In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (FL): StatPearls Publishing; 2024 Jan-.
5. Di Capua D, Bracken-Clarke D, Ronan K, Baird AM, Finn S. The Liquid Biopsy for Lung Cancer: State of the Art, Limitations and Future Developments. Cancers (Basel). 2021 Aug 4;13(16):3923.
6. Hirahata T, Ul Quraish R, Quraish AU, Ul Quraish S, Naz M, Razzaq MA. Liquid Biopsy: A Distinctive Approach to the Diagnosis and Prognosis of Cancer. Cancer Inform. 2022 Feb 7;21:11769351221076062.
7. Khakwani M, Parveen R, Azhar M. Comparison of PAP smear and liquid based cytology as a screening method for cervical carcinoma. Pak J Med Sci. 2022 Sep-Oct;38(7):1827-1831.
8. Al-Abbadi MA. Basics of cytology. Avicenna J Med. 2011 Jul;1(1):18-28.
9. Pangarkar MA. The Bethesda System for reporting cervical cytology. Cytojournal. 2022 Apr 30;19:28.
10. Kamal M. Pap Smear Collection and Preparation: Key Points. Cytojournal. 2022 Mar 29;19:24.
11. Singh DN, Daripelli S, Elamin Bushara MO, Polevoy GG, Prasanna M. Genetic Testing for Successful Cancer Treatment. Cureus. 2023 Dec 4;15(12):e49889.
12. Forman A, Sotelo J. Tumor-Based Genetic Testing and Familial Cancer Risk. Cold Spring Harb Perspect Med. 2020 Aug 3;10(8):a036590.
13. Rajendran V, Jain MV. In Vitro Tumorigenic Assay: Colony Forming Assay for Cancer Stem Cells. Methods Mol Biol. 2018;1692:89-95.
14. Matsui T, Nuryadi E, Komatsu S, Hirota Y, Shibata A, Oike T, Nakano T. Robustness of Clonogenic Assays as a Biomarker for Cancer Cell Radiosensitivity. Int J Mol Sci. 2019 Aug 25;20(17):4148.
15. Pijuan J, Barceló C, Moreno DF, Maiques O, Sisó P, Marti RM, Macià A, Panosa A. In vitro Cell Migration, Invasion, and Adhesion Assays: From Cell Imaging to Data Analysis. Front Cell Dev Biol. 2019 Jun 14;7:107.
16. Chen TL, Yang HC, Hung CY, Ou MH, Pan YY, Cheng ML, Stern A, Lo SJ, Chiu DT. Impaired embryonic development in glucose-6-phosphate dehydrogenase-deficient Caenorhabditis elegans due to abnormal redox homeostasis induced activation of calcium-independent phospholipase and alteration of glycerophospholipid metabolism. Cell Death Dis. 2017 Jan 12;8(1):e2545.
17. Riss T, Niles A, Moravec R, et al. Cytotoxicity Assays: In Vitro Methods to Measure Dead Cells. 2019 May 1. In: Markossian S, Grossman A, Brimacombe K, et al., editors. Assay Guidance Manual [Internet]. Bethesda (MD): Eli Lilly & Company and the National Center for Advancing Translational Sciences; 2004-.
18. Gordon JL, Brown MA, Reynolds MM. Cell-Based Methods for Determination of Efficacy for Candidate Therapeutics in the Clinical Management of Cancer. Diseases. 2018 Sep 22;6(4):85.
19. Tutty MA, Holmes S, Prina-Mello A. Cancer Cell Culture: The Basics and Two-Dimensional Cultures. In: Movia, D., Prina-Mello, A. (eds) Cancer Cell Culture. Methods in Molecular Biology. 2023. vol 2645. Humana, New York, NY.