Purifikasi plasmid merupakan proses penting dalam bioteknologi yang bertujuan untuk mendapatkan DNA plasmid yang murni dari sel bakteri. Ini merupakan prosedur umum dalam biologi molekuler, sering dilakukan untuk memperoleh DNA plasmid yang digunakan dalam eksperimen seperti kloning, ekspresi gen, atau sekuensing. Plasmid komersial saat ini tersedia dalam berbagai ukuran dan fungsinya juga sangat beragam sesuai di artikel Mengenal Plasmid dalam Penelitian Genetik sebelumnya. Sejarah purifikasi plasmid atau isolasi plasmid DNA ini bermula pada tahun 1970-an, ketika para ilmuwan mulai menyelidiki plasmid sebagai alat untuk rekayasa genetika. Sebelum teknik purifikasi plasmid berkembang, penelitian genetika terbatas karena keterbatasan dalam memisahkan dan mengisolasi DNA plasmid dari sel bakteri. Berikut adalah beberapa tonggak penting dalam sejarah purifikasi plasmid:

1. Penemuan Plasmid (1950 – 1960-an)
   Plasmid pertama kali ditemukan pada akhir 1950 hingga awal 1960-an oleh para ilmuwan seperti Joshua Lederberg dan Stanley Falkow. Mereka mengidentifikasi plasmid sebagai molekul DNA kecil yang terpisah dari kromosom utama dalam bakteri dan dapat membawa gen yang memberikan keuntungan selektif, seperti resistansi terhadap antibiotik.
2. Awal Penggunaan Plasmid dalam Rekayasa Genetika (1970-an)
   Pada tahun 1970-an, penemuan plasmid sebagai vektor genetik membuka jalan bagi rekayasa genetika. Plasmid menjadi alat yang digunakan untuk mengekspresikan gen asing dalam sel bakteri. Proses ini membutuhkan purifikasi plasmid yang efektif dan efisien.Molecular cloning (kloning molekuler) dimulai, di mana plasmid digunakan untuk memasukkan gen tertentu ke dalam bakteri, yang kemudian dapat menggandakan gen tersebut.
3. Metode Purifikasi Plasmid (1970 – 1980-an)
   Pada awal 1970-an, metode isolasi plasmid mulai dikembangkan, tetapi masih dalam bentuk sederhana dan sering melibatkan penggunaan enzim protease dan fenol untuk memisahkan DNA plasmid dari DNA genomik dan kontaminan lain. Proses ini masih sangat memakan waktu dan tidak efisien.Teknik alkaline lysis atau lisis basa (yang dikembangkan pada tahun 1979 oleh Birnboim dan Doly) menjadi langkah besar dalam purifikasi plasmid. Metode ini memungkinkan ekstraksi plasmid DNA dari bakteri dengan menggunakan larutan alkali, yang memisahkan plasmid dari DNA genomik bakteri dan protein lainnya.
4. Kits Komersial (1980 – 1990-an)
   Pada 1980 dan 1990-an, berbagai perusahaan mulai mengembangkan kit purifikasi plasmid komersial yang berbasis pada teknik alkaline lysis dan pemurnian menggunakan kolom silika. Kit ini memudahkan para ilmuwan dalam mendapatkan plasmid DNA berkualitas tinggi secara cepat dan efisien. Teknologi ini membuat teknik purifikasi plasmid lebih standar, memungkinkan penggunaan teknik tersebut dalam berbagai laboratorium di seluruh dunia.
5. Pengembangan Teknik Purifikasi (2000-an hingga sekarang)
   Seiring waktu, teknik dan kit purifikasi plasmid semakin berkembang dengan berbagai variasi seperti miniprep, midiprep, dan maxiprep, yang memungkinkan isolasi plasmid dalam berbagai skala. Selain itu, dengan kemajuan dalam teknik automasi dan teknologi pemurnian berbasis kolom dan resin, purifikasi plasmid kini dapat dilakukan dengan lebih cepat dan lebih efisien. Secara keseluruhan, purifikasi plasmid telah mengalami perkembangan yang pesat seiring dengan kemajuan dalam rekayasa genetika dan bioteknologi. Teknik-teknik modern memungkinkan ilmuwan untuk mendapatkan plasmid DNA yang sangat murni dan berkualitas tinggi untuk berbagai aplikasi seperti kloning, ekspresi gen, atau produksi protein rekombinan.

Prinsip Purifikasi Plasmid

1. Lisis Sel: Sel bakteri, biasanya pada Escherichia coli, dilisis untuk melepaskan isi sel, termasuk plasmid. Lisis ini dilakukan dengan menggunakan larutan lisis yang mengandung deterjen (seperti SDS) dan alkali (NaOH) untuk menghancurkan membran sel dan denaturasi DNA kromosom.
2. Separasi Berdasarkan Berat Jenis: Setelah lisis, campuran disentrifugasi untuk memisahkan komponen berdasarkan berat jenisnya. DNA plasmid yang lebih kecil tetap dalam larutan, sementara protein dan DNA kromosom membentuk pelet.
3. Presipitasi Kimiawi: Penggunaan alkohol (etanol atau isopropanol) untuk mengendapkan DNA plasmid dari larutan. Proses ini mengurangi kelarutan DNA sehingga dapat dipisahkan dari kontaminan lainnya.
4. Adsorpsi Silika: Metode ini memanfaatkan kolom silika di mana DNA plasmid berikatan dengan permukaan silika pada kolom spin dalam kondisi garam tinggi (chaotropic salts). Kontaminan seperti protein dan RNA terbuang selama pencucian.

Metode Purifikasi Plasmid

1. Metode Alkali Lisis

Langkah-langkah:

• • Resuspensi sel dalam buffer lisis.
  • Penambahan larutan lisis (NaOH dan SDS) untuk melisiskan sel.
  • Netralisasi dengan kalium asetat.
  • Sentrifugasi untuk memisahkan supernatan yang mengandung plasmid.
  • Presipitasi dengan etanol dingin untuk mendapatkan DNA plasmid.

2. Kolom Silika

Prosedur:

• • Supernatan dari lisis dimasukkan ke dalam kolom silika.
  • DNA terikat pada kolom saat sentrifugasi.
  • Pencucian dilakukan untuk menghilangkan kontaminan.
  • Elusi dilakukan dengan buffer elusi untuk mendapatkan DNA murni.

3. Metode Fenol-Kloroform

Tahapan:

• • Ekstraksi menggunakan campuran fenol-kloroform untuk memisahkan DNA dari protein.
  • Presipitasi dengan etanol untuk mendapatkan DNA plasmid.

4. Teknik Adsorpsi Magnetik

Partikel magnetik berlapis silika mengikat DNA plasmid. Medan magnet digunakan untuk memisahkan partikel-DNA dari larutan.

Faktor Penentu Keberhasilan

• Kualitas Buffer Lisis: Konsentrasi SDS dan NaOH harus optimal untuk menghindari kerusakan plasmid.
• Suhu dan Waktu Inkubasi: Inkubasi terlalu lama pada kondisi alkali dapat merusak DNA plasmid.
• Kemurnian Elusi: Penggunaan buffer elusi bebas kontaminan meningkatkan kemurnian DNA.

Hasil purifikasi yang optimal ditandai dengan rasio absorbansi 260/280 nm ~1,8-2,0 dan pita DNA tunggal pada elektroforesis. Metode kolom silika dan alkali lisis paling umum digunakan karena efisiensi dan kemudahan protokol.

Produk-Produk untuk Purifikasi Plasmid dari PT. Indogen Intertama

PT INDOGEN INTERTAMA, selaku distributor penyedia kebutuhan uji laboratorium untuk skala riset, klinis dan industrial menawarkan beberapa produk yang dapat digunakan untuk tujuan purifikasi plasmid. Salah satunya dari NovoPro yang merupakan penyedia plasmid untuk berbagai aplikasi dan penelitian yang diinginkan. Berikut kami tautkan kebutuhan vektor sirkular oleh NovoPro (list vektor atau plasmids dari Novopro). Selain itu, PT Indogen juga selaku penyedia plasmid dari Solarbio (list produk plasmid Solarbio).

Tujuan dari purifikasi plasmid adalah untuk mengisolasi DNA plasmid yang murni dan berkualitas tinggi yang dapat digunakan untuk eksperimen lebih lanjut, seperti transfeksi, PCR, atau sekuensing. Beberapa aplikasi terkait metode purifikasi plasmid antara lain, yaitu Teknik Transformasi Genetik pada Tanaman Bagian 1: Transformasi Tidak Langsung dan Teknik Transformasi Genetik pada Tanaman Bagian 2: Transformasi Langsung.

Daftar Pustaka

Aini, A. N., Sarjono, P. R., & Aminin, A. L. N. (2014, December 19). Pemurnian DNA Plasmid Puc19 Menggunakan Kolom Silika dengan Denaturan Urea. Diponegoro University. https://ejournal.undip.ac.id/index.php/sm/article/view/7905

Lathifa, U. S. (2023). Optimasi Pemurnian DNA Plasmid dengan Metode Kromatografi Penukar Ion dalam Pengembangan Proses Produksi Vaksin Berbasis mRNA. https://etd.repository.ugm.ac.id/penelitian/detail/232449

Marcelo E. Tolmasky, Juan Carlos Alonso. 2015. Plasmids: biology and impact in biotechnology and discovery. ASM Press.

William V. Dashek. 2018. Methods in plant biochemistry and molecular biology. CRC Press.