Pengertian Kultur Sel

Kultur sel merupakan metodologi laboratorium yang memungkinkan pertumbuhan sel eukariotik atau prokariotik dalam kondisi fisiologis terkontrol. Jenis aplikasi sel kultur sangat beragam, namun dalam konteks klinis, kultur sel dihubungkan dengan pembuatan model untuk mempelajari biologi sel dasar, mereplikasi mekanisme penyakit, atau menyelidiki toksisitas senyawa obat baru. Homogenitas populasi sel klon atau tipe sel spesifik diiringi dengan sistem kultur yang terdefinisi dengan baik dapat menghilangkan variabel genetik atau lingkungan pengganggu. Dengan demikian, hal itu memungkinkan pembuatan data dengan reproduktifitas dan konsistensi tinggi dibandingkan mempelajari seluruh sistem organ secara in vivo.

Keamanan Laboratorium Kultur Sel

Penerapan teknik kultur sel dalam penelitian biomedis membutuhkan manajemen potensi bahaya terkait agen infeksi serta kontrol reagen toksik, korosif, atau mutagenik. Potensi bahaya dapat membahayakan kesehatan personil laboratorium apabila masuk ke dalam tubuh dan mengancam lingkungan bila ditangani dengan tidak tepat.

Prinsip Kerja Kultur Sel Aseptik

Infeksi mikrobiologi merupakan masalah utama untuk pemeliharaan sel in vitro. Agen infeksi seperti bakteri bersifat toksik bagi sel eukariotik dan mampu menyebabkan kematian sel. Tingkat kontaminasi yang rendah sekalipun juga dapat menghasilkan hasil abnormal dan menyebabkan interpretasi data menjadi salah. Eliminasi infeksi dapat dilakukan dengan mensterilisasi peralatan, media, komponen kultur sel, inkubator, permukaan kerja, dan bejana kultur yang terkontaminasi ataupun terbuka.

Alat Laboratorium Kultur Sel

Berikut peralatan-peralatan yang direkomendasikan untuk laboratorium dasar kultur kel:

• Biological Safety Cabinet – Menciptakan lingkungan permukaan yang steril (kelas II dan/atau III)
• Inkubator CO2 – Menyediakan lingkungan fisiologis untuk pertumbuhan sel
• Mikroskop Cahaya Inverted – Untuk menilai morfologi sel dan menghitung se
• Kulkas, Freezer (−20°C, −80°C), Cryotank Nitrogen Cair – Penyimpanan sel, material sel, dan komponen kultur
• Sentrifugasi – Memadatkan sel
• pH meter – Menentukan pH komponen media yang sesuai
• Pipet dan pipettor – Penentuan volume yang sesuai
• Media sel dan komponen suplementasi – Membiakkan sel dalam komponen spesifik
• Hemocytometer – Perhitungan sel, kinetika pertumbuhan dan densitas
• Autoklaf – Sterilisasi peralatan bersentuhan dengan sel
• Pompa vakum – Aspirasi media kultur sel
• Water bath – Penyesuaian suhu media
• Cawan kultur sel – Pengembangbiakkan sel dalam berbagai format
• Wadah limbah (biohazard) – Pembuangan limbah yang benar

Tabel 1. Peralatan dasar laboratorium kultur sel dari BEING Scientific Inc. dengan berbagai spesifikasi

Gambar 1. Peralatan dasar yang dibutuhkan untuk laboratorium kultur sel (BEING Scientific Inc.)

Persyaratan Lingkungan Untuk Kerja Aseptik

Udara atmosfer mengandung berbagai partikel mikro beragregasi dengan mikroba infeksius. Biological Safety cabinet merupakan peralatan paling penting untuk membatasi aerosol non-steril dan komponen udara untuk tidak mengkontaminasi sel kultur. Inkubator stainless steel memudahkan pembersihan dan melindungi permukaan dari korosi lingkungan yang lembab. Menjaga semua permukaan lain yang bersentuhan dengan vessel kultur sel atau komponen media tetap bersih adalah suatu keharusan, mulai dari inkubator, sentrifugasi, mikroskop, water bath, kulkas dan freezer. Peralatan yang disimpan di ruang kultur sel harus selalu bebas dari debu dan disarankan untuk membersihkan lantai kultur sel secara teratur.

Menggunakan Reagen Aseptik dan Media untuk Kultur Sel

Sumber utama kontaminasi yaitu personil laboratorium, lingkungan dan media kultur. Media komersial dan produk kultur sel umumnya dalam kondisi steril. Apabila pembuatan media kultur sel menggunakan reagen kultur nonsteril, maka sterilisasi filter digunakan. Filter-sterilisasi cairan dapat dilakukan dengan memaksa cairan melalui sistem filter pengikat rendah polietersulfon 0,22μM menggunakan pompa vakum. Penambahan antibiotik (misalnya, Penicillin/Streptomycin) selanjutnya juga mampu membatasi risiko pertumbuhan bakteri dalam botol media apabila setelah dibuka dan pada bejana kultur sel. Namun, diingat untuk tidak selalu menggunakan antibiotik secara rutin karena dapat memfasilitasi munculnya strain bakteri yang resisten, memungkinkan kontaminasi latar tingkat rendah, serta dapat menyebabkan gangguan pada metabolisme sel dan hasil eksperimen.

Kontaminasi

Dikarenakan kontaminasi biasanyanya sulit dihindari, penting untuk melatih personil laboratorium untuk mengenali tanda-tanda awal untuk mencegah penyebaran kontaminan ke sel atau produk kultur sel lainnya. Kontaminan umumnya bersifat biologis dan dapat mencakup bakteri, jamur, virus, dan parasit. Kontaminan biologis dapat mengubah fenotipe dan genotipe cell line yang dikultur melalui kompetisi untuk nutrisi, sintesis produk sampingan basa, asam atau toksin, serta potensi interferensi komponen virus dengan genom kultur sel. Kontaminan lain non-biologis misalnya, pengkhelat pada bejana kultur sel atau jenis sel lain yang dapat mengurangi aktivitas proliferasi sel dan menyebabkan kematian sel. Pemantauan kontaminasi berkala dapat menggunakan metode PCR, ELISA), immunostaining, turbiditas dan odor (untuk infeksi fungi), imunositokimia atau observasi mikroskop elektron.

Cell Line

Pemilihan cell line untuk kultur sel sangat bergantung pada sifat fungsional dan pembacaan spesifik. Cell line juga perlu diselaraskan dengan peralatan yang tersedia dan persyaratan penggolongan bahaya spesifik sel tersebut. Introduksi cell line di laboratorium harus selalu disertai dengan tes PCR Mycoplasma untuk memastikan kultur bersih. Sel yang dibiakkan di laboratorium dapat diklasifikasikan menjadi tiga jenis: primary cell, transformed cell dan self-renewing cell.

• Primary cell merupakan sel yang dikembangkan langsung dari jaringan atau organ langsung, misalnya fibroblas dari biopsi kulit dan hepatosit yang diisolasi dari eksplan hati, diisolasi langsung dari jaringan manusia. Penelitian biomedis dan translasi seringkali bergantung pada penggunaan jenis sel ini karena merepresentasikan jaringan asalnya dengan baik. Namun, terdapat beberapa kekurangan jenis sel ini yaitu batasan biosafety yang ketat untuk handling dan jenis sel primer umumnya “terbatas”. Oleh karena itu, sel ini hanya bergantung pada pasokan stok yang berkelanjutan karena proliferasinya dapat berhenti setelah pembelahan sel dalam jumlah tertentu dan ekspansi sel seringkali sulit dilakukan.
• Transformed cell dapat dihasilkan secara alami atau dengan manipulasi genetik. Penggunaan cell ini lebih mengarah ke platform seluler untuk menghasilkan tingkat pertumbuhan cepat dan kondisi stabil untuk pemeliharaan dan kloning. Namun, genotipe yang dimanipulasi dapat menyebabkan kelainan kariotipe dan fenotipe non-fisiologis.
• Self-renewing cell terdiri dari stem cell embrionik, stem cell pluripoten, stem cell neural and intestinal. Sel-sel ini memiliki kemampuan berdiferensiasi menjadi berbagai jenis sel lain dan sifat self-renewing memungkinkan pemeliharaan jangka panjang secara in vitro. Sel-sel ini juga digunakan untuk merepresentasikan kondisi fisiologis relevan dari mekanisme in vivo. Cell lini juga tersedia secara komersial di mana langkah-langkah kontrol kualitas dilakukan yang menjamin stabilitas genomik dan tidak adanya kontaminan. Selain penyedia komersial, cell line ini juga dapat diperoleh dari bank sel atau laboratorium kultur sel.

Media Kultur Sel

Media kultur dapat terdiri dari media basal dengan suplementasi, dengan ketentuan harus mengandung nutrisi seperti karbohidrat, vitamin, asam amino, mineral, faktor pertumbuhan, hormon, serta juga komponen yang mengontrol sifat fisikokimia seperti pH kultur dan tekanan osmotik seluler. Serum dalam bentuk Fetal Bovine Serum (FBS) paling sering ditambahkan ke media basal. Serum memberikan faktor pertumbuhan dan hormon yang berperan sebagai carrier lipid dan enzim yang mentransportasikan mikronutrien dan trace element. Beberapa laboratorium, mengurangi suplementasi media basal seperti serum karena merupakan komponen yang tidak memiliki parameter pasti karena batch produk yang sangat bervariasi selain harga yang cukup tinggi. FBS juga memiliki risiko lainnya dengan menyebabkan efek stimulasi atau inhibisi yang tidak diinginkan pada pertumbuhan dan fungsi sel. Kontaminasi dari FBS juga dapat terjadi apabila bersumber dari pemasok dengan kualitas kontrol rendah. Media dengan serum (FBS) rendah atau media bebas serum yang bergantung pada formulasi konsisten dapat mengurangi penggunaan serum dengan komponen yang lebih pasti. Media ini umumnya menghasilkan kultur sel dengan konsistensi tinggi yang dapat diandalkan untuk aplikasi selanjutnya.

Suhu, pH, Kadar CO2, Kadar O2

Suhu optimal untuk kultur sel bergantung pada suhu tubuh spesies dan suhu area dari jaringan yang dikultur diisolasi. Sebagian besar cell line manusia dan mamalia diinkubasi pada suhu 36–37°C, sedangkan sel dari hewan berdarah dingin dapat diinkubasi diantara 15°C dan 26°C. Tingkat pH fisiologis 7,2–7,4.untuk sebagian besar cell line dikontrol dengan ketat dan dijaga kecuali beberapa sel, misalnya cell line fibroblast dengan kondisi sedikit lebih basa (pH 7,4 dan 7,7). Suhu dan pH dapat dikontrol melalui inkubator CO2 dimana tingkat pH bergantung pada keseimbangan CO2 dan HCO3− (bikarbonat). Buffer pH dapat bersifat organik dan termasuk HEPES (10–25mM) atau MOPS (20mM). Media kultur juga mengandung indikator pH (mis., Fenol merah) yang dapat menunjukkan indikator warna antara kondisi asam (kuning) dan basa (merah muda). Fluktuasi konsentrasi CO2 atmosfer juga dapat mengubah tingkat pH, sehingga tekanan CO2 disesuaikan menjadi 5–7%.

Subkultur

Saat capaian pertumbuhan sel mencapai ~80% pertemuan bejana kultur, sel perlu dipindahkan ke bejana baru untuk melanjutkan proses pertumbuhannya. Proses ini, disebut sebagai “passaging” yang menghasilkan subkultur atau subklon. Untuk melepaskan sel pada substrat maka dibutuhkan proses digesti enzimatik atau proses mekanis. ketika pertumbuhan sel sisa dibatasi atau diperluas dari sisa area tersedia, konsentrasi sel dalam media menciptakan langkah pembatas laju pada kultur suspensi, sehingga penting untuk memonitor tingkat pertumbuhan dalam kultur suspensi dari waktu ke waktu.

Referensi:
1. Aschner M, Costa L. 2019. Cell Culture Techniques. Humana Press. Springer.
2. Jalali M, Saldanha FYL, Jalali M. 2017. Basic Science Methods for Clinical Researchers. Academic Press.
3. Uphoff CC, Drexler HG. 2013. Basic Cell Culture Protocols. Humana Press. Springer.

Related articles:
1. Cell Line Merk Elabscience [Link]
2. Cell line untuk Penelitian SARS-CoV-2 dari Merk Elabscience [Link]
3. Cara Memilih Inkubator Co₂ Yang Tepat Untuk Kultur Sel [Link]
4. 6 Alasan Memilih Kit Deteksi Apoptosis Annexin V Merk Elabscience® [Link]
5. 4 Alasan Memilih Kit Cell Proliferation and Toxicity Merk Elabscience® [Link]
6. 5 Alasan Memilih Kit TUNEL Assay Merk Elabscience® [Link]
7. ICellBox [Link]