A. Kloning cDNA

Gambar 1. Kloning Gen menggunakan cDNA (C.M.Howles, 1996)

Kata “kloning” sendiri berasal dari bahasa Inggris “clone,” yang pertama kali digunakan oleh Herbert J. Webber. Istilah ini diserap dari kata bahasa Yunani, κλών (klōn), yang berarti “cabang” atau “ranting”. Awalnya kata ini digunakan dalam bidang hortikultura untuk menunjuk bahan tanam dalam perbanyakan vegetatif. Secara etimologis, “clone” merujuk pada potongan tanaman yang digunakan untuk memperbanyak tanaman tersebut secara identik.

Dengan kata lain, Kloning adalah proses menghasilkan salinan identik dari organisme, sel, atau DNA dengan materi genetik yang sama atau hampir sama persis dengan aslinya, tanpa melalui reproduksi seksual. Kloning dapat terjadi secara alami, misalnya reproduksi aseksual pada tumbuhan dan mikroorganisme, atau secara buatan melalui teknik bioteknologi.

cDNA adalah singkatan dari complementary DNA atau DNA komplementer. cDNA merupakan molekul DNA yang disintesis dari RNA messenger (mRNA) menggunakan enzim reverse transcriptase. cDNA bersifat komplementer terhadap mRNA, artinya urutan basa pada cDNA cocok dengan urutan basa RNA yang menjadi templatenya.

Dalam bidang bioteknologi, terdapat teknik untuk menghasilkan salinan identik dari DNA komplementer (cDNA) yang disintesis dari mRNA yang disebut dengan Kloning cDNA. Proses ini melibatkan pembuatan cDNA dari mRNA yang mewakili gen yang aktif diekspresikan dalam sel, lalu memperbanyaknya dengan memasukkan cDNA tersebut ke dalam vektor kloning (seperti plasmid), dan menumbuhkannya dalam sel inang (biasanya bakteri) untuk mendapatkan banyak salinan. cDNA ini merupakan DNA sintetik yang hanya mengandung urutan yang mengkode protein (ekson), tanpa intron atau bagian non-kode, sehingga lebih stabil dibandingkan mRNA yang aslinya.

Tujuan kloning secara umum adalah untuk membuat salinan identik dari suatu sel, gen, atau organisme yang memiliki sifat genetika yang sama dengan induknya. Beberapa tujuan penting dari proses kloning antara lain:

• Merekayasa genetik guna menghasilkan individu baru atau salinan gen tertentu.
• Mempercepat pemulihan cedera traumatis dengan meregenerasi sel yang rusak.
• Memodifikasi genetik yang diwariskan dari orang tua agar meminimalisir dan mencegah cacat lahir.
• Memperpanjang usia dengan mengganti sel rusak dan menumbuhkan sel baru.
• Mengatasi masalah infertilitas agar pasangan bisa mendapatkan keturunan.
• Memperbaiki kerusakan gen dan organ tubuh yang mengalami kerusakan.
• Mendukung penelitian medis dan bioteknologi, seperti mengembangkan terapi gen, produksi protein, dan studi genetika.
• Memperbanyak dan mengembangkan bibit unggul untuk pertanian dan peternakan.
• Menghasilkan stem cell yang identik untuk terapi dan penelitian regeneratif

Manfaat kloning cDNA meliputi berbagai aspek, terutama dalam bidang ilmu pengetahuan, kedokteran, pertanian, dan pelestarian lingkungan. Secara rinci, manfaat kloning adalah:

• Mempelajari ekspresi gen secara tepat karena cDNA berasal dari mRNA yang hanya ada pada gen yang diekspresikan dalam sel tertentu.
• Produksi protein rekombinan untuk penelitian dan aplikasi medis, seperti produksi insulin, hormon pertumbuhan, dan antibodi.
• Analisis mutasi dan kelainan genetik dengan mengkloning gen target yang spesifik untuk digunakan dalam diagnostik genetik.
• Pengembangan terapi gen dan pengobatan berbasis genetik untuk penyakit tertentu dengan menggunakan gen yang sudah diklon.
• Memungkinkan pemuliaan dan modifikasi genetik dalam bioteknologi tanaman dan hewan untuk mendapatkan sifat unggul.

Dengan demikian, kloning cDNA merupakan alat penting di bidang bioteknologi, genetika, dan kedokteran untuk penelitian, produksi bahan biologi, serta pengembangan terapi yang lebih spesifik dan efektif.

Namun, kloning juga memiliki dampak atau risiko, yaitu:

• Dampak Biologis dan Kesehatan: Individu hasil kloning seringkali mengalami cacat atau masalah kesehatan yang lebih serius dibandingkan organisme asal.
• Etika dan Sosial: Kloning kontroversial dari segi etika karena dapat mengganggu nilai kehidupan, menimbulkan ketidaksetaraan sosial, dan potensi eksploitasi manusia.
• Lingkungan dan Ekologi: Kloning bisa mengganggu keseimbangan alam jika organisme kloning menyebar tanpa kendali.

Procedure Cloning cDNA

Prosedur cloning cDNA (complementary DNA) secara umum melibatkan beberapa tahapan utama sebagai berikut:

1. Isolasi mRNA
   mRNA dipilih sebagai template karena memiliki ekor poli A khas yang membedakannya dari jenis RNA lain. RNA ini diisolasi dari sel atau jaringan yang diinginkan.
2. Sintesis cDNA untai pertama
   mRNA yang diisolasi digunakan sebagai template untuk sintesis cDNA untai pertama dengan bantuan enzim reverse transcriptase. Primer oligo dT yang menempel pada ekor poli A mRNA digunakan untuk memulai sintesis DNA komplementer.
3. Degradasi mRNA
   Setelah cDNA untai pertama terbentuk, mRNA asli didegradasi menggunakan enzim ribonuklease atau larutan basa sehingga hanya tersisa cDNA.
4. Amplifikasi cDNA
   cDNA hasil sintesis dapat diamplifikasi lebih lanjut dengan metode PCR untuk meningkatkan jumlah salinan cDNA.
5. Fraksinasi dan pemurnian cDNA
   cDNA dapat difraksinasi untuk memilih fragmen dengan ukuran tertentu dan dimurnikan menggunakan teknik kromatografi seperti CHROMA SPIN-400.
6. Persiapan vektor kloning dan transformasi
   Fragmen cDNA yang telah difraksinasi diligasikan ke dalam vektor kloning (misalnya pGEM-T Easy) yang telah dimodifikasi agar sesuai dengan situs pengikatan enzim restriksi. Vektor rekombinan ini kemudian diintroduksi ke dalam sel inang bakteri kompeten (contoh: E. coli DH5α) melalui proses transformasi.
7. Seleksi dan konfirmasi koloni transforman
   Koloni bakteri hasil transformasi dipilih dan diuji keberadaan cDNA sisipan dengan PCR koloni menggunakan primer khusus dari vektor (misalnya primer T7 dan SP6).
8. Hasil amplifikasi yang lebih besar dari ukuran primer menandakan keberhasilan penyisipan cDNA.
   Tahapan ini memungkinkan pengumpulan dan perbanyakan gen yang diinginkan dalam bentuk DNA yang lebih stabil dibandingkan RNA, untuk keperluan penelitian atau aplikasi lainnya.OriGene menyediakan kit kloning cDNA siap pakai yang mudah digunakan, berkualitas andal, dan memberikan cakupan gen yang tinggi, memenuhi kebutuhan high-throughput screening (HTS), gene family research, konstruksi pustaka plasmid, dll. Selengkapnya dapat dilihat pada link berikut Ready-to-use cDNA cloning kit for pathway research or high-throughput screening

Keunggulan Produk

• Cakupan gen yang tinggi: lebih dari 180.000 klon ekspresi tersedia (berlabel atau tidak berlabel)
• Jaminan Kualitas: Produk telah diverifikasi sekuensnya dan siap untuk ekspresi (CMV), dan beberapa produk telah diuji ekspresinya.
• Mudah digunakan: Menyediakan plasmid yang siap untuk transfeksi, sehingga menghilangkan kebutuhan manipulasi/preparasi plasmid E. coli.
• Keunggulan efektivitas biayanya luar biasa: harga satu produk dapat mencapai diskon tertinggi.
• Pengakuan dan reputasi pelanggan: Bertahun-tahun pengalaman industri, pengalaman yang kaya dalam menyediakan paket, dan pengakuan pelanggan yang tinggi.

Gambar 2. Alur kerja High-throughput functional screening dari OriGene

Popular gene expression libraries

Gene Family Expression Library

Gene pathway expression library

B. Viral Gene Delivery

Gambar 3. Viral Gene Delivery

Viral gene delivery adalah metode menggunakan virus yang sudah direkayasa sebagai vektor untuk mengantarkan materi genetik (DNA atau RNA) ke dalam sel target dengan efisiensi tinggi. Virus ini dimodifikasi sehingga bagian genom virus yang menyebabkan infeksi dihilangkan, dan diganti dengan gen yang ingin dikirim. Virus kemudian masuk ke sel target melalui mekanisme alami, melewati membran sel dan mengantarkan gen ke dalam inti sel agar bisa diekspresikan

Virus vektor umum yang digunakan dalam viral gene delivery sebagai alat pengantaran gen meliputi beberapa jenis virus yang telah dimodifikasi agar aman dan efektif, yaitu:

1. Lentivirus (LV)
   • Virus RNA single-stranded yang mampu menginfeksi sel yang aktif membelah maupun tidak aktif.
   • Kapasitas pengantaran DNA sekitar 8 kb.
   • Biasanya tidak menyebabkan respon imunogenik berlebihan.
   • Contohnya adalah lentivirus yang dimodifikasi dari HIV, sering digunakan untuk memasukkan gen dalam terapi gen dan riset.
2. Adenovirus (AdV)
   • Virus DNA double-stranded non-enveloped dengan kapasitas besar sekitar 34-43 kb.
   • menginfeksi berbagai jenis sel mamalia dengan efisiensi tinggi.
   • Namun dapat menimbulkan reaksi imun yang lebih kuat sehingga ekspresi gen umumnya bersifat sementara.
   • Banyak digunakan untuk pengiriman gen dalam penelitian dan terapi eksperimental.
3. Adeno-Associated Virus (AAV)
   • Virus human parvovirus yang non-patogenik dan bentuk ikosahedral.
   • Memiliki respon imun yang rendah dan lebih aman untuk penggunaan klinis.
   • Kapasitas DNA yang dapat dibawa relatif kecil (sekitar 4.7 kb).
   • Telah banyak digunakan dalam uji klinis terapi gen, dengan profil keamanan yang baik.
   • Cocok untuk terapi gen jangka panjang tanpa integrasi acak ke genom inang.
4. Retrovirus
   • Virus RNA yang mengintegrasikan materi genetiknya ke dalam genom host secara permanen.
   • Biasanya hanya menginfeksi sel yang sedang membelah.
   • Membawa risiko mutagenesis jika integrasi terjadi di lokasi genom yang tidak diinginkan

Kelebihan masing-masing vektor berbeda, dan pilihan vektor tergantung pada jenis target sel, ukuran gen yang ingin dikirim, kebutuhan ekspresi gen yang bersifat permanen atau sementara, serta risiko imunogenik yang dapat ditoleransi

Keunggulan viral gene delivery meliputi beberapa aspek utama yang menjadikannya metode pengantaran gen yang sangat efektif dan banyak digunakan dalam riset serta terapi gen:

• Efisiensi Tinggi Pengantaran Gen: Virus memiliki mekanisme alami yang sangat efektif untuk memasukkan materi genetik ke dalam sel target, sehingga viral gene delivery mampu mengantarkan DNA atau RNA dengan efisiensi yang jauh lebih tinggi dibandingkan metode non-viral. Ini terutama berguna untuk sel yang sulit ditransfeksi.
• Kemampuan Ekspresi Jangka Panjang: Beberapa virus seperti lentivirus dapat mengintegrasikan materi genetik ke dalam genom sel inang, sehingga memungkinkan ekspresi gen target secara permanen dan stabil. Hal ini sangat penting untuk terapi gen yang memerlukan ekspresi berkelanjutan
• Spesifisitas dan Ragam Target Sel: Virus vektor bisa diubah agar mengenali dan menginfeksi tipe sel tertentu secara selektif, sehingga meningkatkan efisiensi pengantaran ke target yang diinginkan dan mengurangi efek samping sistemik.
• Kapasitas Membawa Gen yang Memadai: Berbagai jenis virus vektor memiliki kapasitas yang berbeda (misalnya adenovirus hingga sekitar 34-43 kb, lentivirus sekitar 8 kb), memungkinkan pemilihan vektor sesuai ukuran gen target dan aplikasi penelitian
• Adaptasi untuk Berbagai Aplikasi Medis: Viral gene delivery telah digunakan secara luas dalam berbagai bidang, mulai dari terapi gen penyakit genetik, kanker, hingga terapi imun

Procedure Viral Gene Delivery

Prosedur Viral Gene Delivery secara umum meliputi beberapa tahap utama berikut:

1. Pengemasan Virus
   Gen target dimasukkan ke dalam vektor virus yang telah direkayasa. Vektor virus ini dibuat dengan menghilangkan elemen patogenik virus asli dan memasukkan gen terapi beserta sinyal pengemasan yang dibutuhkan. Pengemasan dilakukan dengan mentransfeksi plasmid yang mengkode komponen virus ke dalam sel pengemas tertentu
2. Produksi dan Pengumpulan Virus
   Virus rekombinan diproduksi oleh sel pengemas dan dikumpulkan. Virus matang dapat diperoleh dari dalam sel (misalnya untuk adenovirus, AAV) atau dari medium kultur (misalnya untuk retrovirus, lentivirus).
3. Penghitungan Titer Virus
   Virus yang dihasilkan dihitung jumlah partikel virus fisik maupun partikel virus fungsional yang mampu menginfeksi dan mentransduksi sel target.
4. Pemurnian dan Konsentrasi Virus
   Virus dimurnikan untuk menghilangkan kontaminan yang bisa menghambat proses transduksi, biasanya menggunakan metode kromatografi, filtrasi, atau ultracentrifugasi, serta dikonsentrasikan agar dosisnya tepat.
5. Transduksi Sel Target
   Virus yang sudah dimurnikan dan dikonsentrasikan ditambahkan ke sel target di bawah kondisi yang telah dioptimalkan agar proses pengiriman gen berjalan efektif.
6. Ekspresi dan Pemantauan
   Setelah gen dikirim, gen terapi diekspresikan dalam sel target dan keberhasilannya dipantau untuk memastikan efikasi pengiriman.

OriGene menawarkan berbagai produk dan layanan lentiviral yang komprehensif untuk pengantaran gen yang efisien dan aman.

Produk dan layanan AAV (Adeno-Associated Virus) dari OriGene didesain untuk kebutuhan pengantaran gen yang efisien dan spesifik baik secara in vitro maupun in vivo. Pilih produk aksesori AAV yang mendukung upaya riset Anda dengan mudah.

	Cotransfection adalah teknik dalam biologi molekuler di mana dua atau lebih jenis DNA atau materi genetik dimasukkan secara bersamaan ke dalam sel target menggunakan metode transfection. Teknik ini sering digunakan untuk studi interaksi gen, ekspresi gen ganda, atau pengantaran struktur genetik kompleks yang memerlukan lebih dari satu plasmid. AVV Vectors
	Packaging Cell Line dari OriGene yang umum digunakan untuk produksi viral vector, khususnya lentivirus, adalah sel 293T atau turunan dari sel manusia HEK293 yang telah dimodifikasi. Sel 293T ini sangat populer karena kemampuannya untuk transfect dengan efisiensi tinggi dan memproduksi partikel viral dalam jumlah besar.
	OriGene menyediakan produk dan metode untuk konsentrasi dan pemurnian viral vector, khususnya untuk lentivirus dan AAV (Adeno-Associated Virus) yang dapat di cek pada link berikut AVV Concentrator
	Metode titering viral vector pada OriGene, dapat dilakukan dengan pendekatan produk pada link berikut The OriGene AAV qPCR fast Titer Kit
	AAV Particles Ready for Transduction dari OriGene adalah produk partikel AAV yang sudah jadi dan siap digunakan untuk transduksi in vitro maupun in vivo. Dapat dilihat pada link berikut Premade AAV – ORF® Particles
	Downstream applications produk OriGene terkait viral vector berfokus pada berbagai tahap dan penggunaan yang menyusul setelah produksi dan pemurnian viral vector, antara lain dapat dilihat pada lik berikut : AVV Elisa kit AAV Control Particles AAV Serotyping Kit AAV Antibodies

DAFTAR PUSTAKA

De Haan P, Van Diemen FR, Toscano MG. Viral gene delivery vectors: the next generation medicines for immune-related diseases. Hum Vaccin Immunother. 2021 Jan 2;17(1):14-21. doi: 10.1080/21645515.2020.1757989. Epub 2020 May 15. PMID: 32412865; PMCID: PMC7872028.

Kostylev M, Otwell AE, Richardson RE, Suzuki Y. Cloning Should Be Simple: Escherichia coli DH5α-Mediated Assembly of Multiple DNA Fragments with Short End Homologies. PLoS One. 2015 Sep 8;10(9):e0137466. doi: 10.1371/journal.pone.0137466. PMID: 26348330; PMCID: PMC4562628.

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26837/

https://www.origene.cn/products/cdna-clones/expression-plasmids/clone-set

https://www.origene.com/products/cdna-clones/viral-tools