1. Pemisahan Sel Adheren dari Vessel untuk Subkultur

Sel yang dikultur secara in vitro akan menghabiskan nutrien medium, mengeluarkan metabolit toksik dan bertumbuh dengan pesat. Guna memperluas dan mempertahankan kultur sel untuk tetap sehat, penting untuk menghasilkan subset kultur baru, menghilangkan metabolit toksik dan menambahkan kembali media segar. Waktu tepat untuk passaging sel yaitu saat konfluensi (pertemuan atau persentase penutupan permukaan vessel) mencapai ~80% pada vessel. Sel adheren dapat dicerna secara enzimatik atau dipisahkan secara mekanis dari substrat (misalnya, flask atau petri). Pada BSC, sel dicuci dengan PBS bebas Mg2+ dan Ca2+ untuk menghilangkan sel mati (non-adheren) dan diinkubasi pada 37°C dengan enzim digestif atau zat pengkelat hingga menutupi monolayer sel (misalnya, trypsin, dispase, kolagenase, EDTA). Sekitar 1-60 menit yang diperlukan untuk melepaskan sel dari substrat, nanum lama pemisahan bergantung pada jenis sel dan enzim digestif yang digunakan.

Tingkat disosiasi dapat diamati dibawah mikroskop cahaya dan pengetokkan vessel akan memisahkan sisa sel yang masih menempel. Sel-sel yang berhasil terpisah dikumpulkan dalam tabung centrifuge conical steril dan vessel juga harus dicuci dengan media dengan inhibitor untuk enzim digestif dan agen disosiasi sel. Sel-sel dapat dikonsentrasikan dan dihitung serta ditumbuhkan pada vessel baru pada konsentrasi yang diinginkan. Konsentrasi sel yang lebih rendah (~104 sel/mL) sesuai untuk cell line dengan laju proliferasi cepat, sedangkan konsentrasi sel lebih tinggi (~105 sel/mL) lebih sesuai untuk sel dengan laju pertumbuhan yang lebih lambat.

Tabel 1. Reagen disosiasi sel dari substrat pada vessel

Gambar 1. Alur pemeliharaan sel. Cell line adheren dapat dipelihara pada flask atau petri dan perubahan media secara reguler harus dilakukan untuk memastikan perbanyakan sel. Apabila konfluensi mencapai ~ 80%, sel-sel dipisahkan secara enzimatik atau mekanis dari substrat. Sel-sel yang telah terlepas dapat dikoleksi dalam tabung kerucut dan dijadikan pelet. Dengan subset ini, vassel baru dapat ditanamkan dan sel yang tersisa dapat dibekukan atau digunakan untuk eksperimen berikutnya.

Catatan: Penting untuk selalu mencatat jumlah pasassaging yang telah dilakukan sejak kultur dimulai. Beberapa cell line tidak sesuai untuk eksperimen diluar jumlah passaging karena kecenderungan peningkatan abnormalitas kromosom pada cell line mamalia dengan pembelahan sel konstan.

Tabel 2. Jenis consumables yang digunakan pada kultur sel dengan produk JetBiofil

2. Subkultur Suspensi Kultur

Subkultur suspensi kultur dapat dilakukan dengan membuang sepertiga larutan suspensi sel secara aseptik dan mengganti volume tersebut dengan complete media yang telah dihangatkan sebelumnya.

3. Pembuatan Pelet Sel

Suspensi sel disentrifugasi pada 300×g selama 10 menit untuk mengkonsentrasikan sel, guna dipindahkan ke vessel baru, freezing atau eksperimen lainnya. Setelah supernatan dikeluarkan, pelet sel disuspensikan kembali dalam media melalui pemipetan sel atas-bawah secara perlahan sebanyak tiga kali.

Catatan: Sentrifugasi pada kecepatan tinggi dan pemipetan secara kuat sangat disarankan, karena sel tunggal umumnya sangat rapuh.

4. Kuantifikasi Sel dan Penentuan Viabilitas Sel

Selama proses pengiriman atau handling, sel dapat mati karena sifatnya yang sangat sensitif kondisi kimia, suhu dan waktu. Saat mengandalkan konsentrasi sel hidup tertentu untuk memulai kultur atau membutuhkan sejumlah sel hidup untuk pengujian tertentu, penting untuk mampu membedakan antara sel hidup dan sel mati. Penghitungan sel juga dapat berkontribusi dalam menilai laju pertumbuhan.

Untuk menghasilkan jutaan kultur sel, jumlah sel pertama dihitung dalam volume kecil dan kemudian diperluas hingga volume sel penuh. Demi mencapai hal ini, semua sel dipisahkan, dipelet dan disuspensikan kembali secara merata dalam volume media yang sesuai. Dalam pengenceran 1:1 dengan 0,4% trypan Blue, jumlah kecil suspensi sel dicampur dalam tabung conical dengan memasukkan 10µL campuran sel dalam Trypan Blue ke hemasitometer. Pewarna Trypan Blue selanjutnya hanya mempenetrasi sel-sel nonviable (mati) sehingga dapat dikeluarkan dari kuantifikasi selanjutnya. Pengamatan dapat dilakukan dengan inverted microscope, fase kontras dan perbesaran minimal 10X, untuk semua sel yang terletak di empat kotak terluar dapat dihitung. Sel viable (hidup) menunjukkan adanya “halo” lebih gelap, sedangkan sel mati berwarna biru/hitam.

Penentuan jumlah sel hidup yaitu dengan perhitungan jumlah sel di keempat kotak dan penentuan jumlah rata-rata dalam 1 mm2, dikalikan dengan 104 (untuk mendapatkan jumlah sel per mL), dikalikan dengan 2 (untuk memperhitungkan faktor pengenceran Trypan Blue) serta dikalikan dengan volume media awal dari seluruh suspensi sel. Persentase sel hidup dapat ditentukan dengan membagi jumlah sel tidak diwarnai dengan jumlah total sel, dan mengalikan rasionya dengan 100. Kultur sel sehat ditandai dengan persentase viabilitas sel berkisar 80–95%.

Gambar 2. Determinasi viabilitas sel menggunakan Trypan Blue. Hemasitometer disiapkan dengan menutupi kedua kamar hitung dengan cover glass. Sebanyak 10μL suspensi sel perbandingan 1:1 dengan 0,4% Trypan Blue dimasukan ke filling notch satu ruang hitung. Campuran tersebut akan mengisi kisi-kisi yang dapat diamati dalam inverted microscope pada perbesaran minimal 10X. Rata-rata sel yang menutupi kotak A–D dapat menunjukkan jumlah sel per mm2. Sel-sel viable dalam kotak dihitung dengan mengecualikan sel-sel nonviable berwarna hitam. Hanya sel yang overlapping dengan salah satu batas horizontal dan vertikal luar yang dihitung, sel di luar itu tidak dihitung.

Tabel 3. Deteksi proliferasi sel, sitotoksisitas, viabilitas sel kultur dengan produk Elabscience

Tabel 4. Perhitungan sel dengan hemacytometer Neubauer dari Marienfeld

5 Pembekuan (Freezing) Sel

Jika sel berlebih selama subkultur, sel dapat disimpan dengan malukan pembekuan atau freezing dengan zat krioprotektan (misalnya, gliserol atau DMSO) yang mampu mencegah pembentukan kristal ekstra atau intraseluler yang berbahaya bagi sel. Sel yang terpisah dan dijadikan pelet kemudian disuspensikan kembali dalam 1 mL freezing medium (misalnya, knockout serum replacement medium yang dilengkapi 10% DMSO) dan ~1×106 sel dipindahkan ke cryovial. Setelah 20-30 menit, krioprotektan akan mempenetrasi sel dan selanjutnya dibekukan semalaman pada suhu −80°C dengan laju pembekuan terkontrol 1–2°C/menit, vial kemudian dipindahkan ke nitrogen cair untuk penyimpanan jangka panjang.

Catatan: Gliserol dan DMSO merupakan zat krioprotektan yang sesuai untuk penyimpanan beku sel, namun penanganan DMSO harus sangat diperhatikan dan dilakukan secara hati-hati. DMSO konsentrat bersifat toksik bagi personel laboratorium dan sel sehingga harus diencerkan sebelumnya. Toksisitas ini juga dapat berdampak negatif pada sel dengan media mengandung 10% DMSO, ketika dibiarkan beberapa jam pada suhu ruang, maka diwajibkan untuk mentransfer sel ke suhu -80°C untuk penyimpanan dalam waktu 30 menit. Secara umum, tata tertib penggunaan pakaian dan gloves laboratorium mampu melindungi personel dari bahaya DMSO dan zat terlarut.

Tabel 5. Reagent pada proses pembekuan atau freezing sel dengan produk Elabscience

6 Pencairan (Thawing) Sel Kriopreservasi

Sebagian besar sel mamalia dapat disimpan dalam jangka panjang pada nitrogen cair (<130°C) hingga bertahun-tahun karena penghentian proses biologis. Untuk memulihkan kondisi sel, 10 mL complete media dihangatkan dengan waterbath. Setelah mengeluarkan vial beku dari nitrogen cair, harus segera dimasukkan ke waterbath 37°C dan diputar perlahan hingga dua pertiga isinya mencair. Vial diusap dengan etanol 70% dan ditempatkan dalam BSC di mana 1 mL media yang telah dihangatkan sebelumnya ditambahkan tetes demi tetes ke vial untuk meminimalkan tekanan osmotik. Ketika semua Isi vial sudah mencair, kemudian dipindahkan tetes demi tetes ke 9 mL complete media sisanya dan disentrifugasi pada 300×g selama 3 menit. Setelah supernatan diaspirasi, pelet sel dapat dicuci sekali dalam media untuk menghilangkan sisa zat kriopreservatif. Sel kemudian disuspensikan kembali dalam complete media dan dipindahkan ke vessel. Penempelan sel harusnya dapat terjadi dalam 24 jam.

Catatan: Viabilitas sel setelah kriopreservasi dipengaruhi oleh kemampuannya untuk mengatasi stres akibat freezing (pembekuan) dan thawing (pencairan). Dengan demikian, disarankan untuk melakukan proses pencairan secepat mungkin. Saat menangani cryovial yang telah dibekukan dengan gliserol sebagai krioprotektan, pencairan dapat disederhanakan dengan mengencerkan sel kriopreservasi sepuluh kali langsung ke complete media yang dihangatkan sebelumnya, sehingga menghindari langkah sentrifugasi dan pencucian.

7. Penyelesaian Masalah Kultur Sel

Tabel 6. Kendala dan masalah yang umumnya terjadi pada kultur sel dan solusi yang disarankan

Referensi:

1. Aschner M, Costa L. 2019. Cell Culture Techniques. Humana Press. Springer.
2. Uphoff CC, Drexler HG. 2013. Basic Cell Culture Protocols. Humana Press. Springer.
3. Jalali M, Saldanha FYL, Jalali M. 2017. Basic Science Methods for Clinical Researchers. Academic Press.

Related articles:

1. Cell Line Merk Elabscience [Link]
2. Cell line untuk Penelitian SARS-CoV-2 dari Merk Elabscience [Link]
3. Memahami Konsep Dasar Media Kultur Sel Manusia dan Mamalia [Link]
4. Prinsip Laboratorium Kultur Sel Mamalia: Sistem Model In Vitro [Link]
5. Cara Memilih Inkubator Co₂ Yang Tepat Untuk Kultur Sel [Link]
6. 6 Alasan Memilih Kit Deteksi Apoptosis Annexin V Merk Elabscience® [Link]
7. 4 Alasan Memilih Kit Cell Proliferation and Toxicity Merk Elabscience® [Link]
8. 5 Alasan Memilih Kit TUNEL Assay Merk Elabscience® [Link]
9. ICellBox [Link]