Teknik Imunohistokimia

Berikut adalah langkah-langkah pengerjaan IHK untuk Preparat Parafin.

Deparafinasi dan rehidrasi:

1. Rendam preparat pada xylol I, xylol II, secara berurutan selama 10 menit.
2. Rendam preparat pada alkohol bertingkat: alkohol absolut I, II, III, alkohol 95%, alkohol 80% dan alkohol 70% secara berurutan selama 5 menit, kemudian cuci dengan air deionisasi selama 2 menit lakukan sebanyak 2 kali.

Baca juga artikel mengenai 4 metode deteksi kromogenik pada teknik IHC di sini

Pengangkatan Antigen (optional)

1. Rendam preparat pada larutan penyangga 0.01M asam sirat (pH 6.0).
2. Kemudian masukkan ke dalam microwave selama 10 menit (waktu terhitung saat medium mendidih), perhatikan agar jaringan tidak sampai kering.
3. Ambil wadah rendaman preparat kemudian dinginkan suhu ruang. Setelah dingin, angkat preparat dan cuci dengan PBS (pH 7.4) selama 3 menit ulangi 3 kali. Note: pencucian jangan langsung ke jaringan agar jaringan tidak pecah.

Inaktivasi

1. Teteskan H2O2 3% ke preparat secara perlahan untuk memblok enzim peroksidase dalam sel. Lalu diamkan di suhu kamar selama 15 menit dalam larutan  H2O2 30%, terakhir cuci preparat dengan PBS selama 3 menit ulangi 3 kali.

Inkubasi Antibodi

1. Bersihkan kertas absorbent dengan PBS, tambahkan serum normal 5% (tambah antibodi sekunder dengan jenis spesies yang sama atau mirip) setetes setetes pada kertas absorbent, lalu dilakukan pemblokiran pada suhu 37℃ selama ½ jam.
2. Jika ada cairan di sekitar jaringan preparat dikeringkan dengan kertas absorbent, kemudian buat tanda lingkaran dengan oil pen di sekitar jaringan yang akan diamati, lalu teteskan antibodi primer yang telah diencerkan. Masukan PBS di bagian kontrol, jika tidak memiliki kontrol negatifnya. Setelah ditambahkan antibodi primer yang telah diencerkan, preparat diletakkan pada wadah basah dan disimpan dalam suhu 4℃ semalaman. (Pengenceran antibodi sebelumnya sudah dilakukan optimasi dahulu untuk menentukan pengenceran yang tepat).
3. Preparat dicuci dengan PBS sebanyak 3x, masing masing selama 2 menit, keringkan preparat dengan kertas absorbent, lalu tambahkan antibodi sekunder terkonjugasi HRP dan inkubasi dalam suhu 37℃ selama 30 menit.

Deteksi Sinyal

1. Lakukan pencucian pada preparat selama 3 menit, diulang 4 kali, keringkan dengan kertas absorbent, masukkan DAB substrate tetes demi tetes keseluruh bagian jaringan, lalu amati di bawah mikroskop. Sinyal positive ditandai dengan warna coklat kekuningan atau coklat. Pada proses ini perlu diperhatikan agar warna tidak terlalu gelap, jika terjadi reaksi maka hentikan dengan air mengalir.
2. Pewarnaan Hematoxylin: rendam preparat dalam larutan Harris hematoxylin selama ½ – 1 menit, kemudian cuci dengan air dan rendam dalam larutan alkohol + HCL 1%, terakhir cuci lagi dengan air (optional).

Dehidrasi dan Mounting

1. Pertama rendam preparat dan cuci dengan air, kemudian rendam dengan larutan alkohol dan xylol bertingkat: Alkohol 70%, 80%, 90%, 95%, alkohol absolut I, alkohol absolut II, xylol I dan xylol II. Lakukan perendaman masing masing larutan selama 2 menit dan keringkan di lemari asam.
2. Preparat ditutup dengan cover glass, usahakan jangan sampai terbentuk gelembung udara. Teknik meletakkan penutup kaca objek dengan dimiringkan ke salah satu sisi kemudian tutup perlahan dengan rata. Terakhir keringkan dalam lemari asam.
3. Amati dengan mikroskop preparat yang sudah kering dan ambil gambarnya.