Kultur sel merupakan teknik eksperimen dasar untuk life science, yang banyak digunakan dalam penelitian ilmiah dan produksi/industri. Dalam Kultur sel banyak yang perlu diperhatikan mulai dari Resusitasi, subkultur, penggantian medium sampai cryopreservasi sel. Dalam rangka mempelajari lebih dalam mengenai kultur sel ini kami PT. INDOGEN INTERTAMA berkesempatan untuk melihat proses pengerjaan kultur sel di dalam laboratorium cell culture Elabscience, Wuhan, China.

Prosedur Cell Culture / Kultur Sel

A. Resusitasi

Resusitasi dalam kultur sel merupakan proses dimana sel dalam bentuk frozen dicairkan atau thawing sampai dengan ditempatkan pada media pertumbuhan pertama. Biasanya penyimpanan cell dalam sedian beku dalam suhu <-190℃ maka dari itu untuk menghidupkan kembali cell beku memerlukan teknik khusus untuk mencairkannya kembali agar hidup dengan recovery tidak jauh beda dengan sebelum dilakukan pembekuan.

Gambar 1. Pengambilan Sel dari dalam Tanki Nitrogen

Berikut tahapan resusitasi sel yang diambil dari cryotank:

1. Siapkan waterbath dengan suhu 37℃

2. Bawa keluar sel yang dibutuhkan untuk selanjutnya di thawing. Lakukan secepat mungkin.

Gambar 2. Proses Thawing Sel

3. Letakan vial berisi sel di waterbath sambil digoyang-goyangkan, selama kurang lebih 1-2 menit.

4. Angkat vial begitu cair sempurna.

5. Tuang sel ke dalam tube 50ml yang berisi medium dasar yang telah disiapkan sebelumnya (RPMI 1640).
Note: Sesuaikan medium yang digunakan berdasarkan tipe sel yang akan di kultur. Terdapat 2 tipe sel yaitu adherant dan suspension sel.

Gambar 3. Persiapan Sentrifugasi Sel

6. Lakukan sentrifugasi dengan kecepatan 1200rpm selama 3 menit.

7. Siapkan Medium pertumbuhan Complete Growth Medium pada TC petri dish 9cm sebanyak ±10ml.
Note: Complete Growth Medium sudah berisi medium dasar, Suplemen dan Antibiotik/antimikotik.
Stem Cell Complete Growth Medium dapat anda temukan disini.

8. Setelah selesai sentrifugasi, buang supernatan.

9. Masukan medium yang telah disiapkan sebelumnya ke dalam tabung sebanyak 1ml, kemudian tuangkan ke dalam petri berisi medium menggunakan mikropipet secara perlahan.

Gambar 4. Pemindahan Sel ke Petri dish

10. Pastikan sel dalam petridish tersebar merata, dengan mengamatinya di bawah mikroskop inverted.

Gambar 5. Pengamatan Kultur Sel

11. Masukan petridish berisi sel ke dalam CO2 inkubator.

Gambar 6. Inkubasi Sel dalam CO2 Incubator

12. Inkubasi selama 24 jam.

B. Subkultur

Setelah inkubasi 24 jam sel akan ditumbuhkan kembali namun sebelumnya dilakukan perhitungan jumlah sel dahulu. Hal yang perlu diperhatikan saat berjalannya subkultur diantaranya, yaitu:

> Mempertahankan sel tidak terkontaminasi
Kontaminasi yang dapat terjadi biasanya dikarenakan oleh Bakteri, jamur, bahkan mikoplasma/nanobacteria. Sebagai pencegahannya medium dapat ditambahkan dengan antibiotik/antifungi dan bahkan anti mikoplasma. Berikut produk yang dapat kami tawarkan.

Tabel 1. Antibakteri, antifungi, dan anti mycoplasma / nanobakteri dari Brand Elabscience

> Memastikan sel konfluen 80% sebelum dipanen

Berikut tahapan untuk subkultur sel:

1. Dikarenakan sel yang akan di subkultur merupakan jenis sel Adherent maka tahapan ini khusus untuk sel adherent.
2. Ambil sel dari CO2 Incubator.
3. Buang media pada petri dish.
4. Tambahkan larutan PBS 1x pada perti dan bilas perlahan.
   Note: Posisikan tips pada dinding petri dish saat penambahan PBS.
5. Tambahkan Trypsin ± 2.5ml pada petri dish.
   Note: jumlah volume trypsin menyesuaikan dengan luas area pertumbuhan sel.
6. Buang trypsin secara perlahan menggunakan mikropipet.
7. Masukan kembali petri dish ke dalam CO2 Incubator sekitar 2 menit.
8. Setelah inkubasi 2 menit, tambahkan complete medium pada petri dish tersebut hingga merata sampai mengenai semua permukaan petri.
9. Ambil sel  tersebut dan pindahkan ke dalam tube sentrifugasi kemudian resuspensi secara perlahan hingga homogen dan lakukan perhitungan jumlah sel.
10. Perhitungan jumlah sel dilakukan secara otomatis menggunakan alat automatic cell counter.
11. Ambil 10uL sel kemudian tempatkan pada slide count.
12. Catat Jumlah sel dan viabilitas sel pada alat. Pada alat jumlah sel yang terhitung 1.25×10⁶/ml. Jadi untuk total pada 2ml medium adalah 2.5×10⁶.
13. Jumlah kepadatan Sel adherent umumnya 1 x 10⁵ cell per 10ml pada cawan petri. Maka untuk subkultur pertama dapat diambil 1 ml dari tube dan pindahkan ke dalam petri dish yang baru dengan medium pertumbuhannya. Kemudian masukan dalam CO2 incubator selama 2-3 hari sampai sel memenuhi konfluensi 80%, baru dilakukan proses penyimpanan cryopreservasi.
14. Sisa sekitar 1 ml diambil untuk proses cryopreservasi.

C. Kriopreservasi / Cryopreservation

Cryopreservation merupakan proses pengawetan sel, jaringan, organel maupun komponen biologis lainnya dengan cara mendinginkan sampel sampai dengan suhu yang sangat rendah. Hal yang perlu diperhatikan dalam proses ini salah satunya yaitu medium freezing yang sesuai. Elabscience menyediakan 2 jenis medium freezing sebagai berikut:

Tabel 2. Freezing Medium dari Brand Elabscience

Umumnya medium cryopreservasi mengandung Medium basal, FBS (Fetal Bovine Serum) dan Cryoprotectant seperti DMSO. Adapun komposisi dalam General Freezing Medium dari Elabscience dapat anda lihat di bawah ini.

Gambar 7. Komposisi General Freezing Medium

Pada freezing medium serum free ini cocok untuk konvensional cell line, sel primer, cell terapi yang mengharuskan bebas serum dan sel ekspresi protein. Juga dengan ini anda dapat menghemat waktu pembekuan gradien serta menyimpan cost untuk pembelian alat maha seperti Controlled-Rate Freezer. Sel dapat ditempatkan pada suhu -80°C, dan dipindahkan ke nitrogen cair keesokan harinya.

Berikut tahapan dari Kriopreservasi:

1. Siapkan sel yang telah konfluen 80%, lakukan perhitungan.
Note: jumlah sel yang disimpan menyesuaikan dengan kebutuhan, biasanya 1×10⁶ per vial.

2. Siapkan medium freezing sebanyak 500uL ke dalam cryovial 1.8ml.

3. Masukan sel yang telah dihitung, ambil 500uL sel dan masukan ke dalam cryovial.

4. Letakkan cryovial dalam cool cell freezing container atau freezing container berisi isopropil alkohol. Simpan dalam Freezer -80℃ selama 24 jam.

Gambar 8. Proses Penyimpanan Sel dalam Freezing Container

5. Setelah semalaman sel dalam cryovial dapat langsung dipindahkan ke dalam tank nitrogen.
Note: khusus penggunaan Freezing medium serum free. Jika penggunaan general freezing medium harus dilakukan pembekuan gradien.

Artikel terkait:

1. Cell Culture Product
2. Stem Cell Culture Media
3. Primary Cell Culture Media
4. Tips Memilih Liquid Nitrogen Tank
5. Perbedaan Cell Line dan Sel Primer : Cell Lines vs. Primary Cells