Uji Aktifitas Antioksidan dengan Metode DPPH

Antioksidan merupakan molekul yang mampu memperlambat atau mencegah oksidasi molekul lainnya. Antioksidan mencegah kerusakan sel akibat spesies oksigen reaktif/ROS yang dihasilkan selama reaksi oksidasi di dalam sel. Terdapat 3 kategori spesies antioksidan: sistem enzim (GSH reductase, catalase, peroxidase, dsb.), molekul kecil (askorbat, asam urat, GSH, vitamin E, dsb) dan protein (albumin, transferrin, dsb.). Masing-masing jenis antioksidan ini memiliki kemampuan reduksi radikal bebas yang berbeda.

Di Jepang, antioksidan digunakan secara luas sebagai aditif pada makanan guna mencegah tengik yang disebabkan proses oksidatif dan diskolorasi oksidatif lemak dan minyak pada makanan. Karena degradasi oksidatif makanan mengurangi nilai makanan itu sendiri dan menelan makanan yang mengandung peroksida berbahaya bagi tubuh manusia, karenanya antioksidan memiliki peranan penting. Sehingga, evaluasi kualitas antioksidan sangat krusial.

Pada uji antioksidan digunakan Trolox untuk menstandarisasi antioksidan, artinya jumlah antioksidan yang diukur setara Trolox. Pengukuran kapasitas antioksidan nonenzimatik gabungan antara cairan biologis dan sampel lainnya memberikan indikasi kemampuan keseluruhan untuk menangkal spesies oksigen reaktif (ROS) dan juga ketahanan terhadap kerusakan oksidatif dan memerangi penyakit yang berkaitan stres oksidatif seperti penyakit Alzheimer, Parkinson, diabetes, rheumatoid arthritis dan neurogenerasi.

Pada beberapa kasus, kontribusi dari antioksidan protein dibutuhkan sedangkan pada kasus lainnya kontribusi antioksidan molekul kecil yang dibutuhkan. BioVision mengembangkan TAC Assay Kit, yang dapat mengukur kombinasi antioksidan molekul kecil dan dan protein atau hanya molekul kecil saja dengan adanya Protein Mask (paten). Ion Cu2+ diubah menjadi Cu+ oleh molekul kecil dan protein.  Protein Mask mencegah reduksi Cu2+ oleh protein, yang memungkinkan analisis hanya antioksidan molekul kecil saja.  Ion Cu+ tereduksi merupakan kelat dengan probe kolorimetrik memberikan puncak absorbansi 570nm, proporsional dengan kapasitas total antioksidan.

Uji DPPH sangat populer pada riset antioksidan bahan alam. Salah satu alasannya adalah metodenya simpel dan sensitif. Assay ini didasarkan atas teori bahwa donor hidrogen merupakan antioksidan. Uji ini mengukur senyawa yang merupakan scavenger radikal bebas.

Gambar 1 menunjukkan mekanisme  DPPH• menerima hidrogen dari antioksidan. DPPH • adalah satu dari sedikit radikal nitrogen organik yang stabil dan tersedia secara komersial. Efek antioksidan sebanding dengan hilangnya DPPH dalam sampel uji. Pengukuran DPPH • dengan spektrometer UV telah menjadi metode yang paling umum digunakan karena kesederhanaan dan akurasinya. DPPH • menunjukkan penyerapan maksimum yang kuat pada gelombang 517 nm (ungu). Warna berubah dari ungu menjadi kuning diikuti oleh pembentukan DPPH setelah penyerapan hidrogen dari antioksidan. Reaksi ini adalah reaksi stoikiometrik sehubungan dengan jumlah atom hidrogen yang diserap. Oleh karena itu, efek antioksidan dapat dengan mudah dievaluasi dengan mengikuti penurunan penyerapan UV pada 517 nm.

Gambar 1. DPPH•  radikal bebas berubah menjadi DPPH oleh adanya antioksidan

INDOGEN menyuplai reagen DPPH serbuk (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl Free Radical) dari TCI Chemical Jepang kemasan 1 gram. INDOGEN juga menjual kit antioxidant Assay merk Bioassay Systems dari USA dan menjual Total Antioxidant Capacity (TAC) Colorimetric Assay Kit merk Biovision USA.