Materi Workshop

1. Sample Preparation: Pembuatan Ekstrak Herbal, Uji Kualitatif dan Kuantitatif Senyawa Metabolit Ekstrak Herbal

● Dr. Ade Arsianti, S.Si, M.Si: Ketua Klaster Drug Development Research Center (DDRC) IMERI FKUI

a. Persiapan sampel dilakukan di Klaster DDRC IMERI FKUI Lantai 11. Daun anting-anting atau nama latin dari Acalypha Indica digunakan sebagai sampel uji pada workshop kali ini. Daun Acalypha Indica sudah dalam bentuk ekstrak pekat akan diuji secara Kualitatif dan Kuantitatif.

b. Uji Kualitatif

b.1 Skrining Senyawa Fitokimia

Fitokimia yang akan dilihat diantaranya: Alkaloid, Steroid / Terpenoid, Flavonoid, Saponin, dan Tanin.

Uji Alkaloid: Menggunakan Reagen Dragendorff, Mayer, Wagner. Hasil positif ditandai dengan endapan berwarna jingga setelah ditambahkan reagen Dragendorf, warna putih kekuningan untuk reagen Mayer dan endapan coklat setelah ditambah reagen Wagner.

Uji Steroid dan Terpenoid: Menggunakan pereaksi Liebermann-Burchard. Adanya steroid ditandai dengan cincin warna hijau kebiruan, sedangkan adanya Terpenoid ditandai dengan warna coklat, merah atau ungu.

Uji Flavonoid: Menggunakan reagen logam Mg, HCl pekat dan amil alkohol (Sebelumnya ekstrak dilarutkan dengan air panas). Hasil positif ditandai dengan warna kuning kemerahan (jingga) / merah / hijau pada fraksi amil alkohol.

Uji Saponin: Ekstrak yang ditambahkan air panas lalu dikocok akan berbuih dan buih masih ada menandakan terdapat Saponin walaupun telah diteteskan HCl 2N.

Uji Tanin: Penambahan FeCl3 1% pada ekstrak yang telah dicampur air hangat menandakan hasil positif dengan ditandai warna biru hitam/hijau-kehitaman.

Gambar 2. Pengerjaan Skrining Fitokimia

b.2 Penentuan Senyawa Menggunakan Thin Liquid Chromatography (TLC)

TLC atau disebut juga kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan metode kromatografi yang paling sederhana untuk analisis kualitatif. Prinsip kerja dari kromatografi KLT ini adalah distribusi senyawa antara fase diam yang mana berupa padatan akan diletakkan pada plat KLT dan fase diam yang berupa cairan di mana cairan ini bergerak di atas fase diam. Pada pengerjaan TLC, pelarut sangat berpengaruh terhadap distribusi analit sehingga perlu diperhatikan polaritas dan kekuatan elusinya. Dalam Workshop kali ini pelarut sudah dioptimasi terlebih dahulu, Kloroform:Metanol:Asam asetat, 5:1:0.1.

Gambar 3. Pengerjaan Thin Liquid Chromatography (TLC)

Selama pelarut bergerak, campuran masing-masing senyawa akan tetap pada fase diam atau larut dalam pelarut sehingga komponen-komponen dalam sampel (senyawa) tersebut dapat terpisah. Senyawa bergerak naik atau tetap pada fase diam tergantung pada sifat fisik masing-masing senyawa. Kemudian setelah terbentuknya bercak diamati menggunakan lampu UV.

c. Uji Kuantitatif

Uji Kuantitatif menggunakan alat Spektrofotometer UV-VIS untuk menguji Total Flavonoid dan Fenolik. Baik Flavoid maupun Fenolik menggunakan standar, yaitu Quercetin sebagai standar Flavonoid dan Asam Galat sebagai standar Fenolik. Selain itu beberapa pelarut dan pereaksi lainnya dibutuhkan pada pencampuran sampel ekstrak. Setelah campuran bereaksi, selanjutnya dibaca pada alat Spektrofotometer UV-VIS dengan panjang gelombang tertentu. Untuk menentukan Flavonoid pembacaan pada 376 nm, sedangkan Fenolik dapat dibaca pada panjang gelombang 725 nm.

2. Animal Handling: Handling, Sonde, Pengecekan Gula darah

● Dr. Dra Puspita Eka Wuyung, MS: Ketua Klaster Animal Research Facilities (ARF) IMERI-FKUI

Klaster ARF IMERI FKUI Lantai 1 Menyediakan Fasilitas untuk Penelitian hewan yang lengkap. Pengenalan mendasar mengenai Hewan Uji dijelaskan oleh Ketua Klaster Dr. Dra Puspita Eka Wuyung, MS (Gambar 5).

Pengenalan Fasilitas, Teknik Menyonde dan Memeriksa Gula darah hewan uji Mencit dipandu oleh drh. Rosemary Ceria, M.Biomed beserta asistennya.

Gambar 6. Kegiatan Workshop di Klaster ARF IMERI FKUI

3. ELISA: Pengukuran Kadar Leptin Metode ELISA

● dr. Dicky L Tahapary, Sp.PD-KEMD, PhD.: Ketua Klaster Metabolic Disorder, Cardiovascular and Aging (MVA) IMERI FKUI

Pengerjaan ELISA dilakukan di Klaster MVA IMERI FKUI Lantai 5 ditemani oleh laboran Ibu Dini dan Ibu Ine. ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay) adalah teknik biologis berdasar imunoreaksi antigen dan antibodi serta reaksi katalitik enzim yang efisien. Teknik ini digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif protein target dalam sampel seperti serum, plasma, homogenat jaringan, cell culture, dan cairan biologis lainnya.

Baca juga Prinsip Kerja Elisa klik disini.

Workshop yang dilaksanakan di IMERI ini menggunakan Human LEP(Leptin) ELISA Kit Catalog E-EL-H6017 keluaran Elabscience, kami sebagai Distributor ELISA Kit Elabscience di Indonesia turut serta berpartisipasi dalam acara ini. Komponen dari Human LEP(Leptin) ELISA Kit diantaranya:

– Micro ELISA Plate (Dismountable): 8 wells ×12 strips
– Reference Standard: 2 vials
– Concentrated Biotinylated Detection Ab(100×): 1 vial, 120 μL
– Concentrated HRP Conjugate (100×): 1 vial, 120 μL
– Reference Standard & Sample Diluent: 2 vials, 20 mL
– Biotinylated Detection Ab Diluent: 1 vial, 14 mL
– HRP Conjugate Diluent: 1 vial, 14 mL
– Concentrated Wash Buffer(25×): 1 vial, 30mL
– Substrate Reagent: 1 vial, 10mL
– Stop Solution: 1 vial, 10mL
– Plate Sealer: 5pcs
– Product Description: 1 copy
– Certificate of Analysis: 1 copy

Mengenai Komponen ELISA kit dapat juga dibaca pada link disini

Tahapan dari pengerjaan Human LEP(Leptin) ELISA Kit tersebut sebagai berikut:

1. Preparasi Sampel

Sampel berasal dari Serum Manusia FDR Diabetes Melitus tipe 2 (DMT2), sampel dilakukan 50X pengenceran.

2. Preparasi Reagent

a. Letakan kit pada suhu ruang.

b. Wash Buffer: Untuk membuat 750mL Wash buffer maka: 30 mL Concentrated Wash Buffer didilusi ke dalam 720 mL aquades.

c. Standard working solution: Sentrifugasi Standard pada 10.000xg selama 1 menit lalu ditambahkan 1 mL Reference Standard and Sample Diluent lalu dibiarkan terhomogenisasi selama 10 menit secara bersamaan dihomogenisasi perlahan “up and down” dengan mikropipet. Setelah tercampur merata, larutan ini merupakan working solution 1000 pg/mL. Untuk standard dibutuhkan konsentrasi bertingkat 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.63, 0 pg/mL. ambil 7 tube 1,5 mL dan diberi label 2-8 lalu masing-masing tube ditambahkan 500 uL Reference Standard and Sample Diluent. Diambil 500 uL dari working solution 1000 pg/mL untuk ditambahkan ke tube 2, laturan ini sebagai working solution 500 pg/mL. Ulangi tahap ini (sesuai dengan ilustrasi dibawah) sampai ke tube ke-7. Blank merupakan tube 8 yang hanya berisi Reference Standard & Sample Diluent.

d. Biotinylated Detection Ab working solution: Biotinylated Detection Ab Working Solution (100 uL/well) dibuat pada saat sebelum digunakan) maka, perlu dihitung kebutuhan dalam 1 waktu pengerjaan ELISA. Concentrated Biotinylated Detection Ab sentrifugasi pada 800xg selama 1 menit lalu didilusi 100x (Concentrated Biotinylated Detection Ab: Biotinylated Detection Ab Diluent=1:99) untuk menjadi Biotinylated Detection Ab Working Solution.

e. HRP Conjugate working solution: HRP Conjugate Working Solution (100 uL/well) dibuat pada saat sebelum digunakan) maka, perlu dihitung kebutuhan dalam 1 waktu pengerjaan ELISA. Concentrated HRP Conjugate sentrifugasi pada 800xg selama 1 menit lalu didilusi 100x (Concentrated HRP Conjugate: HRP Conjugate Diluent= 1:99) untuk menjadi HRP Conjugate Working Solution.

3. Sampel, standar dan blank dimasukkan 100 uL pada masing-masing well.

Gambar 8. Tahap memasukan sampel, standard, dan blank pada well plate ELISA

Catatan: Pada saat memasukkan sample, hindarkan ujung tips menyentuh dasar well dan minimalisasi pembentukan gelembung air atau buih.

4. Tutup plate dengan cover sealer lalu inkubasi pada suhu 37ºC selama 90 menit.

5. Larutan yang sudah diinkubasi selama 90 menit diambil secara perlahan dengan ujung tips tanpa menyentuh dasar well plate. Tambahkan 100 uL Biotinylated Detection Ab Working Solution setiap well dan tutup dengan cover sealer yang baru lalu diinkubasi pada suhu 37ºC selama 60 menit.

6. Larutan yang sudah diinkubasi selama 60 menit diambil secara perlahan dengan ujung tips tanpa menyentuh dasar well plate. Ditambahkan 350 uL wash buffer pada setiap well lalu inkubasi selama 1 menit kemudian wash buffer diambil menggunakan pipet dan keringkan plate secara perlahan dengan mengetukkan sisi atas well plate pada tisu kering. Ulangi prosedur ini sebanyak 3 kali.

Catatan: Usahakan dasar well tidak ada gelembung, ditandai dengan kondisi well secara visual terlihat jernih.

7. Tambahkan 100 uL HRP Conjugate Working Solution pada setiap well kemudian tutup plate dengan cover sealer yang baru lalu inkubasi pada suhu 37ºC selama 30 menit.

8. Larutan yang sudah diinkubasi selama 30 menit diambil lalu dicuci 5 kali seperti pada point 6.

9. Tambahkan 90 uL Substrat reagent pada setiap well lalu tutup dengan cover sealer yang baru kemudian inkubasi pada 37ºC selama 15 menit.

10. Tambahkan 50 uL Stop Solution pada setiap well kemudian diukur absorbansi plate pada microplate reader pada panjang gelombang 450 nm.

Gambar 11. Pembacaan ELISA dengan Microplate Reader