Dalam artikel sebelumnya, kita telah mengeksplorasi perbedaan antara antibodi kelinci dan tikus serta faktor biologis di balik keunggulan antibodi kelinci. Tetapi setelah memilih tipe inang, jenis teknologi yang digunakan untuk menghasilkan antibodi juga penting. Di sini, kami mengeksplorasi beberapa teknologi antibodi monoklonal kelinci yang tersedia di pasaran saat ini
Teknologi Fusi Hibridoma
Sejak pengembangan teknologi fusi hibridoma pada tahun 1975 oleh Georges Kohler dan Cesar Milstein, dan aplikasinya pada pengembangan antibodi monoklonal tikus, telah berdampak besar pada penelitian biomedis modern. Ini merupakan teknologi persiapan antibodi monoklonal tertua: untuk mengabadikan sel B yang mensekresi antibodi dengan menggabungkan limfosit B dan sel myeloma pada hewan yang diimunisasi. Cell line hibridoma yang mengeluarkan antibodi monoklonal kemudian dipilih menggunakan kloning pengenceran terbatas. Antibodi monoklonal diproduksi dalam skala besar dengan memperbanyak kultur strain sel.
Baca juga artikel mengenai Bagaimana Memilih Antibodi untuk Flow Cytometry di sini
Teknologi fusi sel hibridoma adalah teknologi yang paling banyak digunakan dalam pengembangan dan persiapan antibodi monoklonal tikus. Sejak 1980-an, para peneliti telah bekerja pada pengembangan antibodi monoklonal kelinci berdasarkan teknologi hibridoma. Namun, karena kurangnya cell line myeloma kelinci sebagai strain sel fusi, kemajuannya kurang menggembirakan. Oleh karena itu, para peneliti pendahulu juga mencoba membuat cell line hibridoma fusi heterolog menggunakan cell line myeloma murine tikus dan limfosit B kelinci. Namun, metode ini ternyata kurang efektif karena efisiensi fusi rendah, ketidakstabilan genom dan cacat pada pasangan antibodi kelinci rantai berat-rantai ringan.
Abcam sebagai salah satu manufacture dan repositori antibodi terbesar di dunia, memiliki platform antibodi yang disebut RabMab® rabbit monoclonal antibodies. Kelebihan dari RabMab sendiri sebagai berikut:
- ‘Background’ yang rendah berkat pengikatan target yang ditingkatkan
- Memiliki spesifisitas tinggi
- Afinitas tinggi
- Sangat bagus untuk imunohistokimia/IHK karena sensitivitas tinggi tanpa kehilangan spesifisitas
- Ideal untuk deteksi modifikasi pasca-translasi
- Divalidasi dalam berbagai aplikasi seperti western blot, IHC, ICC, dan flow cytometry
Beberapa antibodi primer RabMAb® yang populer diantaranya sebagai berikut:
| Brand | Catalogue Number | Description | Size |
|---|---|---|---|
| ABCAM | ab16667 | Jual Anti-Ki67 antibody [SP6] | 100ul |
| ABCAM | ab205921 | Jual Anti-PD-L1 antibody [28-8] | 50ul |
| ABCAM | ab32572 | Jual Anti-beta Catenin antibody [E247] | 100ul |
| ABCAM | ab51253 | Jual Anti-Alpha-synuclein (phospho S129) antibody [EP1536Y] | 100ul |
Saat ini Abcam menjual lebih dari 14.000 jenis antibodi primer RabMAb®. Lebih detail mengenai teknologi RabMAb® ini dapat ditemukan pada artikel berikut:
Kelebihan Antibodi Monoklonal Kelinci RabMAb® merk ABCAM
Teknologi display library phage
Pada tahun 1985, George Smith et al. menemukan bahwa gen pIII (mengkodekan protein miselia fag) dapat diubah oleh rekayasa genetika untuk mengekspresikan peptida atau sekuens protein yang berbeda tanpa mempengaruhi aktivitas dan fungsi infeksi fag. Penggunaan teknologi tampilan fag untuk skrining antibodi monoklonal dimulai pada awal 1990-an, dan fragmen scFv dan Fab dari antibodi target berhasil diskrining dengan membangun pustaka fag yang mengkode gen antibodi. Saat ini, teknologi tampilan fag masih merupakan metode utama yang digunakan untuk skrining fragmen scFv dan Fab.
Namun, teknologi tampilan fag ini masih memiliki beberapa kelemahan sebagai berikut:
- Ini bergantung pada sistem ekspresi fag dan bakteri prokariotik, sehingga rantai antibodi yang berat dan ringan tidak serta-merta memiliki transkripsi, translasi, modifikasi pasca-translasi, pelipatan dan perakitan yang benar dalam sistem.
- Pasangan rantai berat dan ringan dalam antibodi yang diproduksi menggunakan tampilan fag adalah pasangan buatan acak. Sama seperti teknologi tampilan lainnya (seperti teknologi tampilan sistem pada yeast/ragi), pemasangan tidak dapat benar-benar mencerminkan proses pemasangan rantai di lingkungan in-vivo yang alami.
- Penapisan antibodi monoklonal dengan teknologi tampilan fag juga sangat tergantung pada kapasitas pustaka. Hanya dengan skrining pustaka antibodi dengan keragaman besar, ada kemungkinan mendapatkan antibodi monoklonal kelinci afinitas tinggi.
- Dibandingkan dengan fusi hibridoma, persyaratan teknis jauh lebih tinggi untuk teknologi tampilan fag ini.
Teknologi gabungan NGS dan proteomik
Teknologi NG-XMTTM dikembangkan oleh Cell Signaling Technology pada tahun 2012. Teknologi ini menggabungkan next-generation sequencing (NGS) dengan proteomik. Antibodi diperoleh dari darah perifer hewan yang diimunisasi menggunakan antigen protein dan informasi urutan asam amino diperoleh dengan menggunakan spektrometri massa.
Namun, masih ada beberapa masalah teknis yang belum terpecahkan dalam metode ini, dan belum diperluas ke aplikasi komersial skala besar. Sebagai contoh, informasi pasangan rantai berat / ringan tidak dapat diperoleh dengan menggunakan spektrometri massa dan NGS. Selain itu, setelah mendapatkan informasi gen rantai berat dan ringan yang mengkodekan antibodi, teknik-teknik ini perlu diverifikasi dengan ekspresi rekombinan secara in vitro dan ini tentu saja memakan biaya yang cukup besar.
Teknologi skrining sel tunggal dan kloning
Pustaka tampilan fag untuk skrining antibodi monoklonal kelinci memiliki beberapa kelemahan yang disebutkan di atas, dan teknologi sel hibridoma tradisional masih memiliki efisiensi fusi yang rendah, stabilitas cell line hibridoma yang rendah, dan masih dilindungi dengan paten. Oleh karena itu, sejak awal 2000-an, para peneliti telah mengembangkan generasi baru teknologi pengembangan antibodi monoklonal kelinci yang tidak tergantung pada teknologi fusi hibridoma dan teknologi tampilan fag.
Produksi antibodi monoklonal kelinci dengan metode ini terutama melibatkan pemilihan limfosit B spesifik dengan melakukan flow cytometry multiwarna menggunakan marker permukaan sel B dan kemudian mengkloning gen sel B tunggal rantai berat dan rantai ringan secara in vitro. Keuntungan dari metode ini ada dua. Yaitu pertama, seperti fusi hibridoma, pasangan rantai berat / ringan dari antibodi yang diperoleh sepenuhnya mencerminkan pasangan dalam kondisi alami. Kedua, sel B dapat diisolasi dari limfosit darah perifer, oleh karena itu prosedur skrining dapat dilakukan tanpa membunuh hewan.
Saat ini, metode yang paling umum digunakan untuk mendapatkan gen rantai berat dan ringan antibodi monoklonal yang sesuai dari sel B tunggal adalah direct-PCR dari sel B tunggal.
Secara umum, skrining sel tunggal dan kloning masih memiliki kelemahan berikut dalam aplikasi komersial:
- PCR sel tunggal sangat teknis dan membutuhkan kondisi lingkungan yang sangat spesifik. Selain itu, lebih banyak siklus (umumnya> 50) atau beberapa siklus PCR diperlukan untuk secara efektif memperbanyak gen rantai berat dan ringan dari suatu antibodi. Oleh karena itu, kemungkinan mutasi yang dimediasi PCR pada gen target meningkat, dan antibodi fungsional pun bisa hilang.
- Seperti halnya pada teknologi NGS yang telah dijelaskan di atas, informasi rantai berat / ringan yang diperoleh perlu diverifikasi juga dengan ekspresi rekombinan secara in vitro.
- Karena antibodi komersial terhadap marker permukaan limfosit kelinci B masih jarang, kemurnian limfosit kelinci B yang diperoleh dengan skrining terbatas dan proporsi klon positif yang diperoleh lebih rendah.
- Kloning gen antibodi dari sel tunggal dan verifikasi ekspresi rekombinan in vitro memakan waktu dan cukup menguras tenaga. Oleh karena itu, metode ini tidak cocok untuk skrining berkinerja tinggi.