Eliminasi Endotoksin dalam Proses Ekstraksi Plasmid
Endotoksin adalah lipopolisakarida (LPS) yang merupakan komponen membran sel bakteri Gram-negatif. Setiap molekul endotoksin memiliki bagian hidrofobik, hidrofilik, dan bermuatan yang memberikan karakteristik spesifik yang berkaitan dengan kemungkinan interaksi endotoksin dengan molekul lain. Saat bakteri mati, sebagian kecil dilepaskan ke lingkungan. Selama lisis sel bakteri dalam preparasi plasmid, endotoksin dilepaskan dalam lisat preparasi.
Lapisan luar membran luar merupakan bagian lipid yang sepenuhnya terdiri dari molekul endotoksin. Satu sel Escherichia coli dapat mengandung sekitar 2 juta molekul LPS yang masing-masing mempunyai bagian lipid hidrofobik, kompleks residu gula dan gugus fosfat bermuatan negatif.
Kontaminasi Endotoksin dari Metode Preparasi Plasmid
Struktur kimia dan sifat molekul endotoksin menyebabkan molekul tersebut cenderung untuk membentuk struktur misel. Struktur misel tersebut menyebabkan DNA plasmid seringkali mengalami ko-purifikasi dengan endotoksin. Pada proses ultrasentrifugasi sesium klorida (CsCl), DNA terikat-CsCl mudah terkontaminasi dengan molekul endotoksin yang memiliki densitas hampir serupa dalam kompleks CsCl terhadap plasmid-etidium bromida.
Pada size exclusion- atau gel filtration chromatography resin, molekul endotoksin berukuran besar dengan bentuk misel menyebabkan molekul menunjukkan respon seperti molekul DNA berukuran besar, serta pada anion-exchange chromatography muatan negatif pada endotoksin dapat berinteraksi dengan anion exchange resin sehingga menyebabkan ko-purifikasi endotoksin dan DNA plasmid bersamaan. Metode purifikasi sangat menentukan tingkat kontaminasi endotoksin pada DNA plasmid. MAGEN Ultra-low Endotoxin Plasmid DNA Extraction Kit menghasilkan DNA dengan kemurnian tinggi dan tingkat endotoksin yang relatif sangat rendah.
| Name of Product | No. Catalouge |
|---|---|
| HiPure Plasmid EF Micro Kit (1~10ml) | P1111 |
| HiPure Plasmid EF Mini Kit (5~15ml) | P1112 |
| HiPure Plasmid EF Midi Kit (30~50ml) | P1113 |
| HiPure Plasmid EF Maxi Kit (50~200ml) | P1114 |
| HiPure Plasmid EF Mega Kit (500ml) | P1116 |
| HiPure Plasmid EF Giga Kit (1000ml) | P1117 |
| HiPure Plasmid EF 96 Kit (1~5ml) | P1115 |
Pengukuran Endotoksin
Endotoksin awalnya diukur dalam reaksi penggumpalan antara endotoksin dan protein yang menggumpal pada amoebosit horseshoe crab Limulus polyphemus. Seiring dengan perkembangan teknologi dan sains, saat ini sebagian besar pengukuran endotoksin menggunakan metode fotometri sensitif berdasarkan pada Limulus amoebocyte lysate (LAL) dan substrat penghasil warna sintetis. Kontaminasi LPS biasanya dinyatakan dalam unit endotoksin (EU) dan umumnya 1 ng LPS sebanding dengan 1–10 EU.
| Brand | No. Catalog | Product Name | Test |
|---|---|---|---|
| Lonza | N294-03 | PYROGENT™ Plus Gel Clot LAL Assay (with endotoxin) | 200T |
| Lonza | 192568 | Endotoxin Challenge Vials, >1,000 EU/vial | 25ea |
| Genscript | L00351 | ToxinSensor™ Gel Clot Endotoxin Assay Kit | 40T |
| Charles River | R11012 | Gel-Clot LAL Reagent 50-test vial (5.2 mL) | 50T |
| Charles River | R13006 | Gel-Clot LAL Single-Test Vial (0.2 mL) | 1ea |
Dampak Adanya Endotoksin pada Aplikasi Biologis
Endotoksin dapat mempengaruhi transfeksi DNA ke dalam sel primer dan sel kultur yang sensitif sehingga peningkatan kadar endotoksin menyebabkan penurunan efisiensi transfeksi yang signifikan. Penggunaan DNA plasmid bebas endotoksin dalam terapi gen merupakan hal yang sangat penting karena keberadaan endotoksin mampu menyebabkan berbagai disrupsi fisiologis seperti munculnya demam, syok endotoksik, dan aktivasi kaskade komplemen baik pada hewan dan manusia. Endotoksin juga mengganggu transfeksi in vitro ke dalam sel imun seperti makrofag dan sel B dengan menyebabkan aktivasi nonspesifik dari respon imun dan memicu sintesis mediator imun, seperti IL-1 dan prostaglandin. Penting untuk memastikan bahwa semua peralatan plastik, media, serum, dan DNA plasmid bebas dari kontaminasi LPS untuk menghindari berbagai efek samping terapi dan kesalahan interpretasi hasil dalam riset.
Semua Alat dan Bahan Bebas Endotoksin
Untuk menghindari DNA plasmid terkontaminasi ulang setelah eliminasi endotoksin awal, peralatan plasticware direkomendasikan untuk menggunakan peralatan baru yang disertifikasi bebas pirogen/endotoksin. Pada perusahaan kami PT INDOGEN INTERTAMA, kebutuhan plasticware bebas pirogen/endotoksin dapat ditelusuri pada katalog dari JET-BIOFIL. Endotoksin akan melekat kuat pada glassware dan sulit dihilangkan selama pencucian. Proses autoklaf standar juga tidak memiliki efisiensi eliminasi endotoksin sedikit atau tidak berpengaruh sama sekali pada kadar endotoksin. Selain itu, jika alat yang diautoklaf sebelumnya telah digunakan untuk bakteri, peralatan telah sangat terkontaminasi dengan molekul endotoksin. Pemanasan glassware pada suhu 180 °C semalam diharapkan dapat menghancurkan molekul endotoksin yang melekat pada alat kaca tersebut.
Untuk informasi lebih lanjut tentang penghapusan endotoksin, silakan merujuk ke literatur. Penting juga diingat bahwa untuk selalu mencegah kontaminasi ulang DNA yang telah bebas endotoksin dengan menggunakan reagen dan alat yang bebas endotoksin. Semua buffer dari kit uji harus disertifikasi bebas endotoksin, seperti air yang digunakan untuk pembuatan etanol 70% dan buffer TE untuk resuspensi.
DAFTAR PUSTAKA
- Wang X, Quinn PJ. 2010. Endotoxins: lipopolysaccharides of gram-negative bacteria. Subcell Biochem 53:3-25.
- Ma R, Zhao J, Du HC, Tian S, Li LW. 2012. Removing endotoxin from plasmid samples by Triton X-114 isothermal extraction. Anal Biochem 424(2):124-126.
- Rozkov A, Larsson B, Gillström S, Björnestedt R, Schmidt SR. 2008. Large-scale production of endotoxin-free plasmids for transient expression in mammalian cell culture. Biotechnol Bioeng 99(3):557-566.
- Butash KA, Natarajan P, Young A, Fox DK. 2000. Reexamination of the effect of endotoxin on cell proliferation and transfection efficiency. Biotechniques 29(3):610-4, 616, 618-9.