Telah kita diketahui dalam artikel sebelumnya bahwa Stress Oksidatif dapat merusak komponen biomolekul diantaranya DNA dan RNA. Kerusakan DNA, termasuk kerusakan DNA oksidatif, terbukti terlibat dalam perkembangan berbagai jenis kanker. Baru-baru ini telah diketahui kerusakan RNA akibat oksidatif berhubungan dengan berbagai penyakit neurologis termasuk penyakit Alzheimer, penyakit Parkinson dan Demensia dengan Badan Lewy.

Pendahuluan

Radikal bebas atau Reactive Oxygen Species (ROS) menyebabkan berbagai kerusakan pada DNA/RNA (seperti perubahan basa dan/atau gula, siklisasi basa gula, ikatan silang DNA-protein, dan ikatan silang intra dan antar untai) yang pada gilirannya dapat mengakibatkan kerusakan DNA/RNA. Oksidan Exogenous yang dapat menyebabkan kerusakan DNA dan RNA diantaranya, polusi udara, radiasi pengion, sinar ultraviolet, gaya hidup dan paparan pestisida serta logam. Penting juga diketahui bahwa oksidan endogenous seperti transformasi spontan atau enzimatik dan ROS dari proses seluler (seperti respirasi mitokondria dan respons peradangan) juga dapat menyebabkan kerusakan DNA, terutama ketika proses ini menjadi tidak berfungsi.

Berikut merupakan ilustrasi kerusakan RNA akibat ROS sehingga menimbulkan suatu penyakit.

Gambar 1. Ilustrasi Kerusakan RNA akibat Reactive Oxygen Species (ROS)

Biomarker Untuk Mendeteksi Kerusakan dan Perbaikan DNA/RNA

Berikut di bawah ini kami paparkan Biomarker yang umum digunakan untuk mendeteksi adanya kerusakan dan perbaikan pada DNA atau RNA.

8-OHG & 8-OHdG

Diketahui bahwa guanin adalah nukleobase dengan potensi redoks terendah, sehingga paling rentan terhadap oksidasi. Ada tiga spesies guanin teroksidasi (OGS), yaitu 8‑hydroxy-2′-deoxyguanosine (8-OHdG) dikenal juga dengan 8-oxo-deoxyguanosine (8-oxo-dG) berasal dari DNA, 8-hydroxyguanosine (8-OHG) atau 8-oxo-guanosine (8-oxo-G) berasal dari RNA, dan 8-hydroxyguanine (8-OHGua) atau 8-oxo-guanine (8-oxo-Gua) berasal dari keduanya DNA dan RNA. 8-hydroxyguanine dapat berpasangan secara tidak tepat dengan adenin atau timin dengan efisiensi yang sama atau lebih tinggi dibandingkan dengan sitosin, sehingga mengakibatkan kesalahan penggabungan nukleotida selama sintesis DNA dan RNA.  Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan oleh Leonardo et al., 2021 bahwa keberadaan OGS pada pasien COVID 19 berhubungan dengan kematian pasien.

Gambar 1. OxiSelect™ Oxidative RNA Damage ELISA Kit (8-OHG Quantitation)

Cell Biolabs telah mengembangkan perangkat yang cepat dan andal untuk mendeteksi spesies guanin teroksidasi yang menyebabkan kerusakan DNA dan RNA, diantaranya 8-OHG RNA Damage ELISA dan 8-OHdG DNA Damage ELISA. Selain Cell Biolabs, Cayman juga memiliki kit deteksi dengan marker yang sama, selengkapnya dapat klik disini.

Tabel 1. 8-OHG & 8-OHdG ELISA Kit dari Cell Biolabs

Situs Apyrimidinic (AP Site)

Kerusakan DNA dapat bermanifestasi dalam pembentukan situs Situs APurinic/apirimidinic (AP atau Abasic). Hilangnya basa secara spontan pada sel mamalia diperkirakan antara 50.000 dan 200.000 lokasi per hari. Situs abasic yang tidak diperbaiki dapat menghambat transkripsi dan mungkin bersifat mutagenik. Enzim utama yang memperbaiki situs AP dalam sel mamalia adalah AP endonuklease (APE1), beberapa penelitian melaporkan Apurinic/apirimidinic endonuclease 1 (APE1) dapat mengontrol kualitas RNA dan menurunkan RNA teroksidasi. OxiSelect™ Oxidative DNA Damage Quantitation Kit (AP site) dari Cell Biolabs menyediakan metode sederhana dan mudah digunakan untuk kuantisasi kerusakan DNA dalam bentuk situs abasik. Pengujian ini menggunakan Aldehyde Reactive Probe (ARP) untuk bereaksi secara spesifik dengan gugus aldehida pada cincin terbuka situs AP. Hal ini memungkinkan situs AP diberi label dengan Biotin, diikuti dengan deteksi dengan konjugat Streptavidin-Enzim.

Tabel 2. OxiSelect™ Oxidative DNA Damage Quantitation Kit (AP sites)

Poly (ADP-Ribose)

Poly ADP-ribosylation (PAR) terlibat dalam berbagai fungsi biologis, tetapi salah satu peran yang paling banyak dipelajari adalah pembentukan rantai PAR sebagai respons terhadap kerusakan DNA. Rantai PAR tersebut merekrut protein perbaikan dan perombak kromatin, sehingga meningkatkan proses perbaikan DNA. Cell Biolabs menyediakan Poly (ADP-Ribose) ELISA Kit untuk mendeteksi secara cepat dan perhitungan kadar PAR dalam sampel sel atau jaringan. Penentuan kadar PAR dalam sampel seperti ELISA lainnya yaitu dengan perbandingan kurva standar yang telah diketahui.

Tabel 3. Poly (ADP-Ribose) ELISA Kit

Sinar Ultraviolet (UV) – CPD & 6-4PP

DNA dapat rusak oleh sinar ultraviolet yang mengakibatkan pembentukan dua struktur: cyclobutane pyrimidine dimers (CPD) dan pyrimidine (6-4) pyrimidone photoproducts (6-4PP). Hasilnya adalah mutasi C ke T dan CC ke TT, yang merupakan mutasi p53 paling umum yang ditemukan pada kanker kulit manusia dan tikus. Cell Biolabs menyediakan Kit CPD dan 6-4PP dalam bentuk aplikasi ELISA dan Immunofluorescence (IF).

Tabel 4. Kit deteksi CPD dan 6-4PP (pyrimidine (6-4) pyrimidone photoproduct) dari Cell Biolabs

Kerusakan untai ganda DNA (DNA Double Strand Break (DSB)

Kerusakan untai ganda pada DNA adalah salah satu jenis kerusakan DNA paling berbahaya yang terjadi di dalam sel. Salah satu respons seluler paling awal terhadap pemutusan untai ganda adalah fosforilasi varian histon, H2AX, di lokasi kerusakan DNA. Dalam hitungan detik Ser139 terfosforilasi ketika DSB diinduksi dalam sel mamalia. Fosforilasi residu serin ini menyebabkan kondensasi kromatin dan tampaknya memainkan peran penting dalam perekrutan faktor perbaikan atau pemberi sinyal kerusakan pada lokasi kerusakan DNA.

OxiSelect™ DNA Double-Strand Break Staining Kit dari Cell Biolabs tersedia dengan metode yang mudah digunakan untuk mendeteksi keberadaan DSB dalam sel yang ditumbuhkan dalam pelat mikrotiter. Putusnya untai ganda dapat dideteksi hanya dalam beberapa jam dengan pewarnaan imunofluoresensi histone H2AX terfosforilasi.

Tabel 5. DNA Double Strand Break (DSB) Staining Kit dari Cell Biolabs

Komponen DNA Double Strand Break (DSB) Staining Kit:

1. Anti-Phospho-Histone H2A.X (Ser 139) Antibody (100X) (Part No. 232101): 100 µL.
2. Secondary Antibody, FITC Conjugate (100X) (Part No. 232102): 100 µL.
3. DNA DSB Inducer (20 mM) (Part No. 232103): 50 µL of 20 mM Etoposide in DMSO.

Uji Comet DNA

Uji komet adalah metode yang banyak dipublikasikan untuk mengukur kerusakan DNA sel berbasis immunofluorescence yang diamati di bawah mikroskop fluorescence. Teknik ini cepat dan mudah untuk memilah kerusakan DNA secara umum, apa pun sumbernya. Cell Biolabs memiliki 2 format untuk uji komet ini, yaitu dalam bentuk Assay Kit dan Slide Uji. Berikut daftar produknya.

Tabel 6. Comet Assays and Slides dari Cell Biolabs

Sumber:

1. Li, Z., Wu, J., & DeLeo, C. (2006). RNA damage and surveillance under oxidative stress. IUBMB Life (International Union of Biochemistry and Molecular Biology: Life), 58(10), 581–588.
2. Am J Med Sci. 2021 May; 361(5): 585–590.
3. Mol Cell Biol. 2017 Mar 15; 37(6): e00401-16.

1. DNA / RNA Damage and Repair – Cell Biolabs.