Berikut kami persembahkan metode dan prosedur sorting dan isolasi sel T-reg dengan teknik flowcytometry menggunakan reagen dan antibodi dari Elabscience.

A.  Strategi Staining untuk Flow Cytometry

Di sini kami ingin mejabarkan secara singkat strategi untuk melakukan staining flow cytometry berdasarkan lokasi marker target sel. Dalam operasi flow cytometry, pemahaman jenis marker dan lokasi sangat penting untuk mengkarakterisasi sel dan analisis fungsional yang akurat.

1.  Marker Permukaan

Marker permukaan adalah protein atau karbohidrat yang ditemukan pada membran sel yang berfungsi sebagai pengidentifikasi untuk jenis sel tertentu. Marker tersebut berperan penting dalam adhesi sel, pensinyalan dan respon imun, misalnya CD4, CD8, dan CD19.

2.  Marker Intraseluler

Penanda intraseluler berlokasi di sitoplasma atau organel sel. Untuk mendeteksi marker tersebut diperlukan proses permeabilisasi sel sehingga antibodi dapat mengikat protein target, misalnya sitokin (contohnya, IFN-γ) dan faktor transkripsi (contohnya, Foxp3). Marker ini membantu mengidentifikasi kondisi aktivasi sel, protein fungsional dan subset sel tertentu.

3.  Marker Inti Sel

Marker inti adalah protein terlokalisasi di dalam inti sel dengan fungsi utama dalam meregulasi ekspresi gen, replikasi dan perbaikan DNA, misalnya PCNA (antigen inti sel yang berkembang biak) dan Ki-67 (penanda proliferasi sel). Market ini sangat penting untuk progresi siklus sel dan diferensiasi.

B.  Sel T-regulasi (Treg)

Sel T-regulasi (Treg) atau sel T supresor adalah subpopulasi sel T yang berperan penting dalam memodulasi sistem imun. Sel Treg berfungsi menjaga toleransi terhadap auto-antigen dan mencegah penyakit autoimun. Sel ini juga menekan atau menurunkan regulasi induksi dan proliferasi sel imun lainnya, khususnya sel T efektor (misalnya, CD4+, CD8+, T-reg) dan auto-checking untuk mencegah respons imun eksesif.

Biomarker spesifik untuk sel Treg meliputi CD4, CD25 dan FOXP3. Marker CD4 dapat membantu untuk mengidentifikasi sel sebagai kelompok sel T-helper. Marker CD25 (IL-2 receptor alpha) bersifat sebagai marker spesifik untuk Treg dan FOXP3 merupakan faktor transkripsi untuk fungsi Treg. Sel Treg berdiferensiasi dari garis keturunan sama dengan CD4+ naif dengan bantuan TGF-β (transformasi faktor pertumbuhan beta). Sel Treg umumnya terlibat dalam penyakit autoimun, kanker, transplantasi organ, dan penyembuhan luka. Tingginya kadar Treg di lingkungan mikro tumor dapat mengindikasikan prognosis kanker buruk.

C.  Material untuk Flow Cytometry

Elabscience:

• Phosphate Buffer (PBS): PB180327
• Cell Staining Buffer: E-CK-A107
• FcR Blocking: Purified Anti-Human CD16 Antibody: E-AB-F1236A
• CD4: FITC Anti-Human CD4 Antibody[SK3]: E-AB-F1352C
• CD25: PE Anti-Human CD25 Antibody[BC96]: E-AB-F1194D
• Isotype Control: PE Mouse IgG1, κ Isotype Control[MOPC-21]: E-AB-F09792D
• CD127: APC Anti-Human CD127/IL-7RA Antibody[A019D5]: E-AB-F1152E
• Isotype Control: APC Mouse IgG1, κ Isotype Control[MOPC-21]: E-AB-F09792E
• RPMI-1640: PM150110
• 1% Penicillin/Streptomycin: PB180120
• 1% Glutamine: PB180420
• 1% HEPES: PB180325

Non-Elabscience:

• Antikoagulan Heparin
• Ficoll
• 2μm membrane
• 10% Fetal Bovine Serum

D.  Prosedur Isolasi Sel T-reg

Berikut informasi untuk proses isolasi sel T-reg dengan flow cytometry menggunakan produk yang disediakan oleh Elabscience.

1.  Persiapan Sel

• Preparasi sampel biologis (darah tepi, limpa, atau kelenjar getah bening).
• Isolasi sel mononuklear (PBMC) menggunakan sentrifugasi gradien densitas menggunakan media Ficoll atau setara.

2.  Staining dan Antibodi

Marker antibodi dapat digunakan sebagai panel antibodi dalam identifikasi dan isolasi T-reg:

• Anti-CD4 digunakan untuk mengidentifikasi sel T CD4+.
• Anti-CD25 (IL-2 receptor alpha) digunakan untuk memberi label khusus pada sel T-reg.
• Anti-CD127 (IL-7 receptor alpha) bertujuan untuk mengeluarkan sel T teraktivasi.
• Opsional: Anti-Foxp3 untuk pewarnaan intraseluler (membutuhkan fiksasi dan permeabilisasi sel)

3.  Flow Cytometry

• Staining sel dengan panel antibodi yang telah disiapkan.
• Masukkan juga kontrol isotipe yang sesuai dengan kebutuhan.
• Pengaturan kontrol kompensasi.
• Perolehan data dari flow cytometer.
• Background staining seringkali menimbulkan masalah terutama dalam menentukan populasi sel langka atau marker dengan ekspresi rendah. Kontrol isotipe mengandung antibodi dengan isotipe sama dengan antibodi tetapi tanpa spesifisitas terhadap antigen target. Kontrol ini digunakan untuk mengukur overlap spektral serta untuk bertindak sebagai kontrol negatif demi memastikan interpretasi akurat pewarnaan antibodi spesifik.
• Penyiapan Kontrol Kompensasi: Kontrol isotipe yang sesuai dengan spesies inang dan subkelas Ig dari antibodi primer target perlu digunakan. Populasi positif pada kontrol isotipe harus lebih terang dibandingkan sampel yang akan dianalisis.
• Catatan: Kontrol isotipe tidak boleh digunakan untuk menentukan sel positif vs. negatif atau untuk mengatur gating/gate. Kontrol juga mungkin tidak sesuai untuk staining intraseluler.

Kontrol isotipe yang paling sesuai sesuai:

• Spesies inang (tikus, tikus, manusia).
• Subkelas Ig ( IgG1, IgG2a, IgM).
• Fluorophore antibodi primer (FITC, PE, APC).
• Pengikatan antibodi non-spesifik pada reseptor Fc harus ditentukan dan diblokir. Reseptor Fc ini umumnya ditemukan pada monosit, makrofag, sel dendritik dan sel B untuk memastikan validitas pengikatan.

4.  Strategi Gating

• Gating pada sel hidup (keluarkan sel mati).
• Gating pada sel T CD4+.
• Pada populasi CD4+, gating CD25+.
• Keluarkan sel CD127+ (sel non-Treg).
• Gating pada sel Foxp3+ apabila menggunakan anti-Foxp3 (opsional).
• Strategi gating melibatkan pembuatan gate atau wilayah spesifik untuk membedakan populasi sel yang diinginkan di dalam sampel heterogen.

5.  Penyortiran Sel (Isolasi)

• Sorting T-reg menggunakan Flow-cytometer yang dilengkapi dengan kemampuan penyortiran.
• Koleksi T-reg yang disortir untuk percobaan berikutnya.
• Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS): FACS merupakan metode yang paling umum dengan prinsip pelabelan dengan antibodi fluoresen. Flow-cytometer mendeteksi sinyal fluoresensi pada sel dan sel disortir berdasarkan intensitas fluoresensinya.

6.  Validasi T-reg

• Pengkonfirmasina kemurnian Treg yang diperoleh dengan menganalisis ulang subset menggunakan flow cytometry.
• Assessing ekspresi Foxp3 jika memungkinkan.
• Analisis ulang subset dalam flow cytometry merupakan proses peninjauan kembali populasi sel atau gate spesifik dalam data yang diperoleh.

E. Referensi

1. Milward K, Hester J, Wood KJ. 2019. Isolation of Human Regulatory T Lymphocytes by Fluorescence-Activated Cell Sorting. In: Boyd, A. (eds) Immunological Tolerance. Methods in Molecular Biology. 1899. Humana Press.
2. MacDonald KN, Piret JM, Levings MK. 2019. Methods to manufacture regulatory T cells for cell therapy, Clinical and Experimental Immunology. 197 (1): 52–63.
3. British Society for Immunology. Regulatory T Cells (Tregs).
4. Pitoiset F, Barbié M, Monneret G. et al. 2018. A Standardized Flow Cytometry Procedure for the Monitoring of Regulatory T Cells in Clinical Trials. Cytometry Part B, 94B: 777–782.
5. de St Groth BF, Zhu E, Asad S, Lee L. 2011. Flow Cytometric Detection of Human Regulatory T Cells. In: Kassiotis, G., Liston, A. (eds) Regulatory T Cells. Methods in Molecular Biology. 707. Humana Press.