INDOGEN INTERTAMA berkesempatan untuk melakukan kunjungan sekaligus melaksanakan Training pada salah satu perusahaan bioteknologi terbesar di Wuhan, China yaitu Vendor kami Elabscience.

Gambar 1. Manufacture Elabscience

Elabscience memiliki platform lengkap mulai dari R&D sampai dengan manufaktur. Produk utama Elabscience® meliputi Kit ELISA, Kit CLIA, Antibodi FCM, Produk Kultur Sel, Kit Uji Apoptosis Sel, Kit Uji Metabolisme Sel, Protein Rekombinan, Antibodi, Kit Keamanan Pangan, dan Reagen Lainnya. Hari pertama kami di Elabscience bertemu langsung dengan CEO mereka yaitu Mr. Leng Yibin (gambar 2).

Gambar 2. Foto bersama CEO Elabscience

Training ELISA Kit bersama Elabscience

Selain untuk mempererat kerjasama dengan vendor melalui kunjungan salah satunya Elabscience ini, kami sebagai Distributor di Indonesia juga belajar untuk dapat upgrade pengetahuan dengan melakukan training diantaranya ELISA khusus riset, Food Safety ELISA, Imunohistokimia, Biochemical Assay atau Metabolisme Assay, dan Kultur sel. Pada bagian pertama ini akan kami paparkan pengerjaan ELISA Kit khusus Riset (RUO/Research use only) dan ELISA Food Safety. Adapun marker best seller yang digunakan yaitu Mouse IL-6 (Interleukin 6) ELISA kit katalog. E-EL-M0044 dan CAP (Chloramphenicol) ELISA Kit katalog E-FS-E106 .

Apa itu ELISA?

Sebelum kita melakukan pengerjaan ELISA Kit, penting untuk mengetahui teori mengenai ELISA. ELISA atau enzyme linked immunosorbent assay merupakan sebuah reaksi antibodi antigen. Ini adalah teknik pengujian berbasis pelat yang digunakan untuk mendeteksi dan mengukur zat seperti peptida, protein, antibodi, dan hormon. Enzim yang dikonjugasikan dengan antibodi bereaksi dengan substrat tak berwarna untuk menghasilkan produk berwarna.

ELISA biasanya dilakukan dalam pelat polistirena 96 well. Serum atau sampel tipe lainnya diinkubasi dalam sumur, dan setiap sumur berisi serum yang berbeda. Kontrol positif dan kontrol negatif akan disertakan di antara 96 ​​sampel yang diuji. Antibodi atau antigen yang ada dalam sampel ditangkap oleh antigen atau antibodi yang sesuai yang dilapisi pada permukaan padat. Setelah beberapa waktu, pelat dicuci untuk menghilangkan serum dan antibodi atau antigen yang tidak terikat dengan serangkaian buffer pencuci (wash buffer). Untuk mendeteksi antibodi atau antigen yang terikat, antibodi sekunder yang melekat pada enzim seperti peroksidase atau alkali fosfatase ditambahkan ke setiap sumur. Setelah masa inkubasi, antibodi sekunder yang tidak terikat dicuci. Bila substrat yang sesuai ditambahkan, enzim bereaksi dengannya untuk menghasilkan warna. Warna yang dihasilkan ini dapat diukur sebagai fungsi atau kuantitas antigen atau antibodi yang ada dalam sampel yang diberikan. Intensitas warna/kepadatan optik diukur pada 450nm. Intensitas warna memberikan indikasi jumlah antigen atau antibodi.

Baca selengkapnya mengenai prinsip ELISA disini.

Tahap pengerjaan ELISA Kit RUO

A.   Persiapan Bahan dan Alat

Bahan:

– ELISA Kit:  #E-EL-M0044 Mouse IL-6(Interleukin 6) ELISA Kit

– Sampel: Cell culture sudah disiapkan sebelumnya

– Air destil

– Tabung 1.5ml

– Gelas steril

– Pipet Tips 1000uL, 200uL dan 10uL

– Absorbent Paper

Alat:

– Microplate Reader filter 450nm

– Sentrifugasi

– Vortex

– Mikropipet

– Inkubator 37℃

B.   Prosedur Pengerjaan ELISA Kit RUO

Preparasi Sampel

Sentrifugasi sampel medium sel kultur pada kecepatan 1000×g suhu 2-8℃ selama 20 menit. Pindahkan supernatan pada tabung yang baru.

Preparasi Reagent

1. Pindahkan reagent pada suhu ruang sebelum digunakan.
   Note: untuk sampel tetep dikondisikan dengan cara menempatkan sampel pada coolbox atau cool rack.
2. Buat konsentrasi standard sesuai dengan data sheet, yaitu 2000, 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, dan 0 pg/mL. Dilusi dengan diluent standard & sample.
   Note: sebelum menambahkan diluent, tabung standard sentrifugasi dahulu 10,000×g selama 1 menit.

Gambar 3. Pengenceran Standard Mouse IL-6 ELISA Kit

3. Encerkan Concentrated Biotinylated Detection Ab(100×) menggunakan diluennya dengan perbandingan 1:99.
   Note: sebelum menambahkan diluent, tabung Concentrated Biotinylated Detection Ab sentrifugasi 800×g selama 1 menit dan sesuaikan volumenya dengan jumlah test yang akan dipakai, per well membutuhkan 100µL.
4. Buat larutan pencuci (Wash buffer). Lakukan pengenceran Wash buffer dan air destil dengan perbandingan 1:25.
   Note: sesuaikan dengan jumlah test yang akan dipakai per well membutuhkan 250µL – 300µL untuk satu kali pencucian.
5. Encerkan Concentrated HRP Conjugate (100×) menggunakan diluennya dengan perbandingan 1:99.
   Note: sebelum menambahkan diluent, tabung Concentrated HRP Conjugate sentrifugasi 800×g selama 1 menit dan sesuaikan volumenya dengan jumlah test yang akan dipakai, per well membutuhkan 100µL.

Note: Setiap mengencerkan reagen, lakukan pada waktu mendekati reagen tersebut akan digunakan.

Tahap Pengerjaan ELISA Kit RUO

1. Cek komponen kit sebelum digunakan.

Gambar 4. Pemeriksaan Komponen pada ELISA Kit

2. Buat pemetaan sampel, blank, standard. Buat masing-masing secara duplo atau 2x pengulangan.
3. Siapkan 96 well plate pada meja kerja yang bersih.

Note: Sesuaikan jumlah well yang akan digunakan, well yang tidak dipakai simpan kembali pada suhu sesuai.

4. Masukan blank (hanya diluen standard), standard dengan konsentrasi yg telah dibuat dan sampel masing-masing 100µL. Kemudian tutup dengan sealer dan inkubasi pada inkubator 37℃ selama 90 menit.
   Note: Masukan standard dari konsentrasi rendah ke tinggi untuk mendapatkan hasil yang linear, dan lakukan secara duplo. Setiap memasukan reagent atau sampel pastikan tidak ada cairan yang menempel pada dinding well dan inkubasi tidak perlu shaker karena dapat bercampur antar well.
5. Setelah inkubasi 90 menit selesai, buang cairan. Tambahkan larutan Biotinylated Detection Ab sebanyak 100µL pada well. Kemudian inkubasi kembali pada suhu 37℃ selama 60 menit.
6. Setelah inkubasi 60 menit buang cairan dan lakukan pencucian menggunakan wash buffer sebanyak 250µL sebanyak 3 kali.
   Note: setiap pencucian well digoyang-goyangkan perlahan kemudian buang dan akhir pencucian well diusahakan kering dengan cara membalikan well plate di atas tisu atau kertas absorben.
7. Masukan 100µL HRP Conjugate pada masing-masing well kemudian inkubasi 37℃ selama 30 menit.
8. Tambahkan reagen substrat sebanyak 90µL pada setiap well dan inkubasi 37℃ selama 15 menit.
   Note: Terjadi perubahan warna menjadi biru.
9. Tambahkan stop solution 90µL pada masing-masing well. Terjadi perubahan warna menjadi kuning.
   Note: setelah penambahan stop solution segera mungkin untuk melakukan pembacaan pada alat.

Gambar 5. Penambahan Stop Solution

10. Lakukan pembacaan absorbansi menggunakan microplate reader 450nm. Note: Pindahkan data absorbansi ke dalam excel.

Gambar 6. Pengukuran Absorbansi menggunakan Microplate Reader

C.   Analisa Data ELISA RUO

Analisa data dilakukan menggunakan software OriginPro. Untuk pembuatan kurva pilih 4-PL function.

Gambar 7. Pembuatan Kurva standard menggunakan Software OriginPro

Berikut merupakan hasil konsentrasi IL-6 pada sampel kultur sel Raw264.7 dengan variasi perlakukan sebagai berikut.

Tabel 1. Hasil analisa data Mouse IL-6 ELISA Kit

Note: Pengerjaan ELISA RUO ini merupakan teknik Sandwich ELISA, setiap absorbansi yang dihasilkan dari sampel maupun standar perlu dilakukan pengurangan dengan blanknya. Lain halnya jika anda menggunakan Competitive ELISA maka tidak perlu dilakukan pengurangan dengan blank.

Marker ELISA RUO lainnya, terutama biomarker Sitokin dapat anda temukan disini.