Kultur sel adalah proses mengisolasi sel dari jaringan hewan dan menumbuhkannya dengan sukses dalam medium kultur buatan. Cell line telah banyak digunakan untuk penelitian yang bertujuan mengisolasi dan membudidayakan patogen, skrining penemuan obat, menemukan jalur metabolisme, memproduksi antigen, sebagai subjek untuk transfeksi dan ekspresi gen, serta mempelajari regulasi ekspresi gen dan mekanisme awal evolusi sitotoksisitas yang dimediasi sel, apoptosis, penuaan sel dan banyak lagi. Serangga merupakan salah satu sumber cell line yang banyak dicari. Arthropoda, khususnya yang bukan termasuk krustasea bersama dengan semua kelas vertebrata-telah terbukti menjadi sumber cell line yang bermanfaat; pembuatan cell line fibroblastoid. Upaya untuk memperoleh cell line dari krustasea (kepiting, udang, udang galah, dan kerabatnya) dan invertebrata non arthropoda jarang berhasil. Oleh karena itu, semakin banyak reagen, protokol dan gagasan yang tersedia untuk transfeksi cell serangga.

Pendahuluan

Upaya pertama untuk membiakkan sel serangga secara in vitro dilakukan oleh Goldschmidt, yang pada tahun 1915 membiakkan sel folikel dari gonad pupa jantan Hyalophora cecropia (Saturniidae: Lepidoptera) dalam hemolimfa serangga yang sama.Pada tahun 1935, William Trager adalah orang pertama yang berhasil membudidayakan baculovirus dalam kultur sel ovarium primer larva Bombyx mori (Bombycidae: Lepidoptera) dan mempublikasi penelitiannya. Para peneliti pun mulai mengoptimasi bahan atau medium kultur. Dimulai dengan Trager yang menggunakan 6 bahan, Silver Wyatt menambahkan bahan dalam mediumnya yaitu garam anorganik, gula, asam organik dan asam amino dengan total 34 bahan. Thomas Grace memodifikasi medium yang telah dibuat oleh Wyatt dengan menambahkan vitamin, mengatur rasio ion Na/K dan Ca/Mg, mengubah tekanan osmotik dan pH. Dengan menggunakan medium ini, ia berhasil membuat cell line dari jaringan ovarium B. mori, Antheraea eucalypti, dan jaringan larva Aedes aegypti (Culicidae: Diptera). Selanjutnya, beberapa peneliti mencoba memodifikasi medium sebelumnya berdasarkan kebutuhan mereka. Dengan tersedianya medium yang sesuai untuk membudidayakan sel serangga, kultur sel serangga berkembang dari sekadar menumbuhka sel line hingga mengembangkan protein rekombinan dan vaksin dari sel serangga yang dikultur.

Secara alami serangga terinfeksi baculovirus (BEVS) dan para ilmuwan mulai menggunakan baculovirus ini dalam kultur sel serangga untuk mempelajari infeksinya pada serangga dan memanfaatkannya untuk mengekspresikan protein rekombinan heterolog dalam kultur sel serangga. Sejak saat itu, sistem ekspresi baculovirus (BEVS) digunakan untuk menghasilkan protein rekombinan dalam sel serangga. BEVS ini sekarang digunakan untuk memproduksi vaksin langsung dari vaksin kandidat HIV pertama di dunia dan vaksin lain yang sedang dikembangkan menggunakan sel kultur (High five) dari Trichoplusia ni (Noctuidae: Lepidoptera) hingga vaksin untuk virus SARS-CoV-2 penyebab Covid-19 dan variannya seperti Omicron juga dari sel kultur (sel Sf9) Spodoptera frugiperda (Smith) (Noctuidae: Lepidoptera).

Jenis-jenis kultur sel serangga

Dua teknik utama untuk mengembangkan sel dalam kultur adalah bergantung pada substrat buatan (kultur monolayer/adheren) dan mengambang bebas dalam media kultur (kultur suspensi).

Gambar 1. Sf9 Cell line

Kultur Monolayer/Adheren

Kultur sel monolayer atau adheren adalah cell line yang bergantung pada substrat dan dikultur saat melekat pada substrat. Kultur ini cocok untuk sebagian besar jenis sel, termasuk kultur primer, dan memungkinkan pengamatan visual yang mudah dengan mikroskop inverted. Disosiasi enzimatik atau mekanis digunakan untuk memisahkan sel. Luas permukaan membatasi pertumbuhan, yang membatasi hasil produk dan memerlukan wadah khusus kultur (TC-treated). Jenis kultur digunakan untuk sitologi, produksi berkelanjutan, dan banyak aplikasi penelitian lainnya.

Kultur Suspensi

Kultur suspensi adalah kultur yang bebas di mana perkembangbiakan agregat kecil sel atau sel tunggal terjadi dalam keadaan tersuspensi dalam media cair yang teragitasi. Cocok untuk sel yang diaklimatisasi dengan kultur suspensi serta beberapa jenis sel non-adhesive lainnya (sel hematopoietik). Proses pertumbuhannya lebih mudah, tetapi diperlukan mengetahui jumlah sel harian dan penentuan viabilitas untuk mengetahui pola pertumbuhan; kultur dapat didilusi untuk mempercepat pertumbuhan. Jenis sel ini tidak memerlukan disosiasi enzimatik atau mekanis. Konsentrasi sel dalam medium membatasi pertumbuhannya, sehingga memungkinkan peningkatan skala yang efisien. Kultur ini dapat ditumbuhkan dalam wadah non-tissue-culture-treated, namun memerlukan pengadukan agar dapat pertukaran gas yang cukup. Kultur ini digunakan untuk produksi protein massal, pemanenan batch, dan aplikasi penelitian lainnya.

Medium Kultur Sel Serangga

Kultur sel serangga digunakan secara komersial karena kepraktisannya, dan pada kenyataannya, telah menjadi komponen penting dari bioteknologi modern. Oleh karena itu, diperlukan peningkatan kualitas medium yang lebih baik untuk mendukung pertumbuhan sel. Berbagai jenis media kultur sel serangga tercantum dalam Tabel 1.

Tabel 1. Berbagai jenis media kultur sel serangga

Secara konvensional medium kultur serangga telah banyak diperjualbelikan dengan basis penelitian, medium yang disediakan Elabscience menjadi pilihan yang tepat dalam pengembangan sel kultur serangga. Berikut merupakan Medium kultur sel serangga dari Elabscience (Tabel 2).

Tabel 2. Medium Kultur Sel Serangga dari Elabscience

Medium Konvensional

Mengembangbiakan kultur sel serangga secara in-vitro memerlukan lingkungan seperti aslinya. Sehingga memerlukan medium pertumbuhan awal yang berisi vitamin, asam amino, karbohidrat, dan garam yang dilengkapi dengan suplemen seperti serum atau hemolimfa yang disebut juga sebagai medium konvensional.

Medium Kultur Sel Serangga Serum-free

Dengan mengganti serum dengan komposisi nutrisi dan hormon yang sesuai, medium bebas serum (SFM) menjadi alternatif penggunaan tanpa adanya unsur hewan. Banyak Kultur primer, cell line, sel penghasil protein rekombinan, sejumlah cell line  hibridoma, sel serangga Sf9 dan Sf21 dari Spodoptera frugiperda (Noctuidae: Lepidoptera), dan cell line yang bertindak sebagai inang virus (VERO, MDCK, MDBK), dan lainnya, memiliki formulasi medium bebas serum. Salah satu keuntungan paling signifikan dari penggunaan medium bebas serum adalah fleksibilitas dalam pembuatan medium untuk jenis sel tertentu dengan memilih growth factor yang tepat.

Serum memiliki kelemahan diantaranya, biaya tinggi, risiko mikoplasma atau kontaminasi, pengulangan antar-batch yang rendah, komposisi yang tidak terdefinisi dengan baik, dan tantangan dalam proses downstream. Hal ini menyebabkan terciptanya medium kultur sel serangga bebas serum, yang terbukti sangat berguna dalam produksi skala besar. Konsentrasi serum yang rendah memiliki efek yang cukup untuk mendorong pertumbuhan, menurunkan biaya total, melindungi sel dari stres sampai batas tertentu, dan melindungi protein rekombinan dari serangan proteolitik.

Beberapa medium untuk kultur sel serangga, seperti Ex-Cell 401, Ex-Cell 405, Ex-Cell 420, Express Five, dan SF900-II, sekarang tersedia secara komersial dan digunakan secara luas. Sementara itu, intervensi perusahaan biokimia dalam kultur sel serangga telah menyebabkan peningkatan jumlah medium komersial bebas serum. Berikut merupakan daftar medium kultur sel serangga bebas serum (seringkali bebas protein) yang paling banyak ditemui saat ini (Tabel 3).

Tabel 3. Medium Serum-Free untuk Kultur Sel Serangga

Hal apa saja yang perlu disiapkan dalam Kultur Sel Serangga?

Pada dasarnya dalam mempersiapkan kultur sel serangga maupun sel mamalia sama saja. Hal yang perlu diperhatikan dalam persiapannya yaitu membangun Laboratorium kultur sel dengan perlengkapan penting lainnya. Alat yang perlu disiapkan diantaranya, laminar flow hood khusus kultur sel, reagen steril, mikroskop inverted dengan perbesaran 10× (or 20×) dan 40×, seperangkat pipet, refrigerated incubator dengan suhu 24–28°C, autoclave, dan pembersih udara UV.

Pemilihan medium yang tepat yaitu mengandung karbohidrat, asam amino, dan garam pada konsentrasi yang disesuaikan dengan metabolisme sel serangga merupakan hal sangat penting dalam mengembangkan kultur sel ini. Medium untuk kultur sel serangga biasanya lebih asam (pH: 6,2 hingga 6,9) dan larutan penyangga dengan natrium fosfat; tekanan osmotik juga lebih tinggi daripada media kultur sel mamalia. Menumbuhkan kultur sel baru, digunakan teknik shotgun, yaitu mengexplore setiap medium komersial yang telah beredar. Medium komersial seperti Ex-Cell 405 dan SF900 untuk lepidoptera dan medium Drosophila Schneider untuk Diptera.

Pemeliharaan Kultur Sel Serangga

Sebagian besar kultur sel primer tidak bertahan lebih dari dua bulan; namun, periode singkat ini cukup untuk berbagai pembelajaran dan penelitian, seperti perkembangbiakan virus dalam sel yang dikultur dan penelitian imunosit dalam memediasi respons imun terhadap berbagai rangsangan imunologi.  Morfologi sel (bentuk dan penampakan) harus diamati menggunakan mikroskop inverted setiap 2-3 hari, tanggal, nama kultur, jenis, jumlah, dan sumber medium kultur harus tercantum dalam pencatatan selama pengamatan. Pengamatan dengan mikroskop ini dapat membantu menemukan kontaminasi sejak dini dan mencegah penyebaran kultur lain di laboratorium. Granular di sekitar nukleus, pemisahan sel dari substrat, dan vakuolisasi sitoplasma menunjukkan kontaminasi kultur, penuaan cell line, atau keberadaan senyawa berbahaya dalam media, atau perlunya penggantian medium. Penggunaan laminar flow hood dan prosedur aseptik yang baik dapat membantu dalam pemberian antibiotik dan antimikotik dalam pemeliharaan stok kultur.

Subkultur Sel

Subkultur, yang juga dikenal sebagai passaging, melibatkan pembuangan medium bekas, penambahan media baru, dan pemindahan sel dari wadah lama ke wadah baru yang berisi media pertumbuhan baru, yang memungkinkan cell line atau strain cell line diperbanyak lebih lanjut. Ketika sel menempati semua substrat yang dapat diakses atau ketika sel dalam kultur suspensi melebihi kapasitas media untuk mempertahankan pertumbuhan lebih lanjut, proliferasi sel melambat secara signifikan atau sepenuhnya terhenti. Untuk mempertahankan kepadatan optimal bagi perkembangan sel yang berkepanjangan dan peningkatan proliferasi lebih lanjut, diperlukan penggantian medium baru. Beberapa strain cell line serangga yang digunakan dalam biologi molekuler sel dan penelitian virologi, bioteknologi industri, serta pengelolaan hama serangga dapat dilihat pada list berikut (Tabel 4).

Tabel 4. Cell Line Serangga yang digunakan dalam penelitian Entomologi

Aplikasi Kultur Serangga di masa mendatang

Kultur sel serangga saat ini dinilai sebagai pabrik protein termurah untuk produksi massal protein rekombinan dan pembuatan virus. Ini juga dapat digunakan untuk mempelajari reaksi imun serangga terhadap stres biotik dan abiotik secara in vivo. Kultur sel serangga menawarkan sistem model yang efisien untuk mengevaluasi pemberian dan metabolisme obat, dapat digunakan untuk mengevaluasi cara kerja insektisida dan menganalisis lokasi target baru untuk pengendalian kimia, dapat menjadi sistem model untuk memastikan protein insektisida dan mengevaluasi mekanisme resistensi Bt pada hama serangga. Selain penelitian entomologi, cell line serangga juga dapat digunakan untuk memahami biologi sel dasar, jalur metabolisme, dan efek senyawa toksik dan karsinogenik seperti hidrokarbon aromatik polisiklik, nitrosamin khusus tembakau, Benzo[a] piren, dll.

Sumber:

1. Bayne, C. J. (1998). Chapter 10 Invertebrate Cell Culture Considerations: Insects, Ticks, Shellfish, and Worms. Methods in Cell Biology, 187–201. doi:10.1016/s0091-679x(08)61578-2.
2. Jabez R.B., et al. (2023). Insect cell culture vis-à-vis insect pest control. Egyptian Journal of Biological Pest Control volume 33, Article number: 80 (2023)