Penandaan protein (protein tagging) merupakan aspek penting dalam analisis protein. Aspek ini akan membantu dalam berbagai aplikasi, termasuk pemurnian, immunoassay, dan lainnya yang berkaitan dengan fungsi protein. Tetapi tag mana yang harus dipilih? Artikel ini akan membahas cara menentukan tag afinitas untuk riset protein Anda.

A. Polyhistidine

Tag afinitas polyhistidine dikenal juga dengan His-tag atau His. His-tag terdiri dari enam residu histidine yang berurutan, tetapi dapat bervariasi panjangnya dari dua hingga sepuluh residu histidine. Polyhistidine merupakan tag afinitas yang umum digunakan sehingga banyak perusahaan yang menyediakan tag jenis ini. Histidine dengan mudah membentuk ikatan koordinasi dengan ion logam transisi yang diimobilisasi. Co2+, Cu2+, Ni2+, Zn2+, Ca2+, dan Fe3+ yang diimobilisasi semuanya dapat digunakan untuk memurnikan protein fusi polyhistidine, tetapi Ni2+ adalah yang paling umum digunakan. Jika pemurnian dengan Ni2+ tidak memuaskan, penentuan empiris ion logam transisi yang paling efektif untuk pemurnian protein fusi polihistidin tertentu dapat dilakukan.

Antibodi primer juga telah dikembangkan untuk mendeteksi protein fusi polyhistidine secara in vitro. Akibat dominasi residu histidin dalam sistem mamalia dan serangga, antibodi anti-polyhistidine terkenal sangat luas. Resin Ni2+ juga dapat digunakan untuk mengendapkan protein bertanda polihistidin untuk mendeteksi interaksi protein-protein.

B. Glutathione S-Transferase

Molekul glutathione S-transferase (GST) terminal-N dikodekan oleh vektor ekspresi pGEX E. coli yang diikuti oleh situs pembelahan protease. Kromatografi afinitas glutathione dapat menerima konsentrasi rendah agen denaturasi (2 hingga 3 M urea atau guanidin hidroklorida), agen pereduksi (<10 mM 2-merkaptoetanol atau dithiothreitol), dan deterjen nonionik (2% v / v Tween 20), tergantung pada sifat protein fusi. Protein fusi GST diinkubasi dengan glutathione sepharose untuk memfasilitasi ikatan silang di antara keduanya. Elusi dengan glutathione 10 mM relatif ringan, seringkali menjaga fungsi protein dan antigenisitas. Sebuah chaperonin yang diinduksi oleh sengatan panas E. coli 70 kDa sering kali berkopulasi dengan protein fusi GST yang dielusi. Kontaminan ini dapat dihilangkan dengan perlakuan lisat sel dengan 5 mM MgCl2 dan 5 mM ATP sebelum pemurnian. Selanjutnya, GST dapat dibelah dari protein fusi sementara masih terikat pada glutathione agarose, memberikan metode yang mudah untuk memisahkan GST 26 kDa dari protein yang diinginkan.

Protein fusi GST dapat dideteksi dengan uji kolorimetri dengan substrat GST 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) atau dengan antibodi anti-GST. Pengendapan protein fusi GST dengan glutathione-coupled beads biasanya digunakan untuk mendeteksi interaksi protein-protein atau protein-DNA.

C. Maltose Binding Protein

Gambar 1. Prinsip Maltose binding protein (MBP)
Sumber: https://parts.igem.org/Part:BBa_K4223006

Maltose binding protein (MBP) sering digunakan untuk meningkatkan tingkat ekspresi dan / atau kelarutan mitra fusi, dengan hasil tipikal 10 hingga 40 mg protein fusi per liter kultur. Ukuran tag MBP (45 kDa) juga dapat mempengaruhi fungsi protein. Tidak seperti kromatografi afinitas glutathione, pembelahan proteolitik dari tag saat terikat pada resin amilosa tidak efektif dan protein fusi harus dielusi oleh maltosa bebas sebelum pembelahan. Elusi maltosa 10 mM sudah cukup dan cukup ringan untuk mempertahankan fungsi protein dan antigenisitas. Jika penghilangan proteolitik dari tag MBP dilakukan, maltosa bebas harus dihilangkan dari MBP yang dibelah dengan langkah kromatografi tambahan jika MBP akan mengikat kembali kolom amilosa. Antibodi anti-MBP tersedia untuk mendeteksi protein fusi MBP.

D. Streptavidin/Biotin-based tags

Streptavidin-binding peptide (SBP) memiliki panjang 38 residu dan dapat digunakan untuk melumpuhkan protein fusi pada matriks streptavidin. Selain itu, Strep-Tag dan Strep II-Tag adalah peptida delapan hingga sembilan residu yang mengikat bentuk mutan streptavidin. Strep-Tag diidentifikasi sebagai peptida 8 asam amino yang secara reversibel berikatan dengan kantong yang sama dengan D-biotin. Selama bertahun-tahun, baik peptida (Strep-Tag dan Strep II-Tag) dan inti streptavidin (Strep-Tactin) telah direkayasa untuk afinitas pengikatan yang optimal. Keuntungan khusus menggunakan Strep II-Tag adalah tidak mengganggu pelipatan atau sekresi protein, sehingga cocok untuk mempelajari protein fungsional. Banyak vektor ekspresi yang tersedia secara komersial dapat menggabungkan Strep II-tag ke terminal C atau N dari protein yang diminati untuk diekspresikan dalam sel bakteri, mamalia, dan serangga. Strep II-Tag tahan terhadap protease seluler, tetapi situs pengenalan protease dapat dimasukkan ke dalam vektor kloning. Ini dapat dilepaskan dengan mencuci dengan desthiobiotin, turunan D-biotin. Kolom dapat digunakan 3-5 kali tambahan setelah dicuci dengan HABA (2- [4′-hidroksi-benzeneazo] asam benzoat), yang menghilangkan desthiobiotin dari Strep-Tactin.

Kesimpulan

Pemilihan tag afinitas untuk pemurnian protein dengan jumlah kisaran menengah (0,1-10 mg) protein yang ditandai dan/atau tidak ditandai dengan kemurnian tinggi. Sistem His-tag dan GST-tag berguna karena protein yang ditandai dan tidak ditandai dapat dengan mudah dibuat dari lisat seluler yang sama, dan ada banyak reagen sekunder yang secara khusus digunakan dengan kedua sistem ini. Garis tebal menunjukkan hasil yang diinginkan telah tercapai.

Pemilih tag afinitas untuk pemurnian sejumlah kecil (<0,1 mg) protein yang ditandai dengan kemurnian sedang hingga tinggi. Protein semacam itu dapat digunakan dalam co-imunopresipitasi, Western blotting, far-Western blotting, ELISA, atau uji overlay gel. Karena hanya sejumlah kecil protein yang diperlukan, biasanya tidak perlu untuk mengoptimalkan ekspresi protein, sehingga pilihan tag afinitas didasarkan pada penggunaan akhir untuk tag fusi-yaitu, sebagai pelapor atau untuk deteksi umum. Contoh tag epitop termasuk tag HA, tag FLAG, tag T7, tag Myc, dan lainnya. Berikut merupakan tag afinitas yang umum digunakan untuk purifikasi protein rekombinan terdapat pada Tabel 1.

Tabel 1. Tag afinitas yang umum digunakan untuk purifikasi protein rekombinan

Berikut ini merupakan produk kami dari brand Elabscience yang berupa antibodi tag afinitas protein.

Tabel 2. Produk-Produk Antibodi Tag Afinitas dari Elabscience untuk Protein

Untuk pertanyaan produk dan stok lebih lanjut Bapak/Ibu dapat menghubungi kami PT. Indogen melalui email asri.indogen@gmail.com atau melalui WhatsApp berikut untuk fast respon WhatsApp Indogen.

Referensi

1. Kimple ME, Brill AL, Pasker RL. Overview of affinity tags for protein purification. Curr Protoc Protein Sci. 2013 Sep 24;73:9.9.1-9.9.23. doi: 10.1002/0471140864.ps0909s73. PMID: 24510596; PMCID: PMC4527311.

Artikel Terkait

1. https://indogen.id/metode-purifikasi-dan-isolasi-protein-menggunakan-kit-elabscience/
2. https://indogen.id/komplit-200-elabscience-recombinant-rabbit-monoclonal-antibody/