A. Persiapan dan Ekspresi Pfu DNA Polymerase

Pfu DNA Polymerase merupakan enzim dalam proses PCR (Polymerase Chain Reaction) yang mampu melakukan koreksi kesalahan dalam aplikasi yang memerlukan ketepatan tingkat tinggi seperti kloning. Gen Pfu DNA Polymerase mengkodekan polipeptida yang terdiri dari 775 asam amino dengan berat molekul 90.109 Da. Polimerase ini memiliki aktivitas eksonuklease 3’-5’ yang berfungsi untuk menghilangkan basa yang salah terpasang (proofreading) dan telah dilaporkan menunjukkan tingkat kesalahan yang rendah dalam PCR (1,3×10^-6 mutasi/bp/duplikasi), yaitu sekitar 8 kali lebih rendah dibandingkan dengan Taq Polimerase.

B. Lisis Sel dan Pemurnian Awal

Langkah pertama yang dapat dilakukan untuk mengisolasi Pfu DNA Polymerase adalah pemilihan plasmid. Urutan gen Pfu DNA Polymerase diamplifikasi dan dikloning ke plasmid yang telah dipilih. Forward and reverse primer yang akan digunakan perlu mengandung restriction site Ncol dan Spel restriction site. Setelah pemotongan restriksi pada plasmid dan produk PCR, ligasi dilakukan selama 16 jam dengan suhu 4°C. Selanjutnya, campuran ligasi ditransformasikan ke bakteri (E.Coli) dan plasmid rekombinan dikonfirmasi dengan sekuensing.

Langkah selanjutnya yaitu ekspresi protein. Langkah ini diawali dengan mengambil koloni positif pada bakteri dan diinokulasi pada medium LB broth (mengandung ampisilin dan chloramphenicol) dan dikultur selama 16 jam di suhu 37°C, 200rpm. Kultur awal diinokulasi dengan perbandingan 1:100 ke LB broth (mengandung ampisilin dan chloramphenicol). Apabila nilai OD600 mencapai 0,5, kultur diinduksi dengan 0,5mM IPTG selama total 6 jam. Tiap 1 jam kultur diambil 1mL dan dianalisis profil proteinnya melalui SDS-PAGE 12%. Pita dengan ukuran yang diharapkan dan intensitas tertinggi menandakan jam induksi yang paling optimal.

C. Pemurnian Lanjutan dan Validasi Kualitas Enzim

Gambar 1. Flow Chart Ektraksi Pfu DNA Polymerase

Pemurnian lanjutan dilakukan dengan mensentrifugasi kultur sel bakteri dan sel dilisiskan dengan protein extraction kit. Lysate yang telah disentrifugasi pada 15000 x g selama 15 menit dan supernatan dipanaskan pada 94°C selama 5 menit. Kemudian, fraksi tak larut dipisahkan dari fraksi larut dengan sentrifugasi kembali pada 10000 x g selama 5 menit pada suhu 4°C. Fraksi yang larut didialisis menggunakan buffer yang memiliki kandungan 20mM Tris-Cl pH 7,5, 100mM KCL, 0,1 mM EDTA, 1mM DTT dan 50% gliserol (Pfu Buffer). Selanjutnya, fraksi yang telah melalui dialisisi selama 4 kali dianalisis kemurnian proteinnya melalui SDS PAGE 12%.

Langkah terakhir berupa pengujian fungsi Pfu Polymerase dengan amplifikasi PCR. Pfu Polymerase yang telah dimurnikan, dilakukan amplifikasi PCR menggunakan plasmid sebagai template. Reaksi PCR yang dilakukan dalam volume 20µl yang mengandung 20 mM Tris-CL pH 8,8, 10 mM KCL, 10mM (NH₄)SO₄, 2 mM MgSO₄, 0,1% Triton® X-100, dan 0,1 mg/ml BSA bebas nuklease, 0,2 mM dNTP, 0,6 µM primer p600, dan 150 ng template.

Aktivitas enzimatik Pfu Polymerase dapat dibandingkan dengan Pfu Polymerase komersial berdasar dari intensitas pita hasil amplifikasi PCR. Konsentrasi stok titrasi Pfu Polymerase dibuat bermacam menyesuaikan kebutuhan. Konsentrasi ini dibuat melalui pengenceran dengan buffer Pfu (2x, 5x, 10x, dan 20x). Adapun parameter PCR seperti berikut:

1. Denaturasi awal: 94°C selama 5 menit
2. 35 siklus Denaturasi: 94°C selama 40 detik
3. Annealing: 68°C selama 40 detik
4. Ekstensi: 72°C selama 40 detik
5. Ekstensi akhir: 72°C selama 5 menit

Intensitas pita selanjutnya dapat dianalisis dengan software.

INDOGEN dapat membantu menyuplai reagen yang Anda butuhkan untuk riset terkait Pfu DNA Polymerase. Berikut merupakan daftar produk yang berkaitan dengan riset Pfu DNA Polymerase.

Tabel 1. Daftar Produk yang Berkaitan dengan Riset Pfu DNA Polymerase.

Untuk pertanyaan produk dan stock lebih lanjut Bapak/Ibu dapat menghubungi kontak yang tertera pada laman website Indogen berikut. Terima kasih.

Referensi:

1. https://pmc.ncbi.nlm.nih.gov/articles/PMC6635313/pdf/IJM-11-181.pdf
2. https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S1046592823000475