Aplikasi Metode Flow Cytometry dan Perkembangan Jenis Assay
Selain pengukuran protein permukaan sel dengan antibodi spesifik, flow cytometry telah berkembang menjadi metode yang unggul dalam pengukuran berbagai parameter biologis sebagai berikut:
A. Ekspresi antigen intraseluler
Faktor transkripsi dan molekul intraseluler lainnya dapat diwarnai dengan antibodi terkonjugasi fluorokrom setelah proses fiksasi dan permeabilisasi sel. Flow cytometry dapat memberikan kuantifikasi yang akurat dan analisis high-throughput dibandingkan teknik mikroskopi klasik. Tingkat ekspresi protein pada >100.000 individual sel dapat diukur dan divisualisasikan hanya dalam beberapa menit. Namun, kelemahan pewarnaan internal ini yaitu cenderung memiliki background yang tinggi, sedangkan metode fiksasi dan permeabilisasi optimal bervariasi (misalnya: formaldehida 0,01%, PFA 1–4% atau aseton diikuti oleh 0,1–1% NP-40 atau metanol dingin, dan lain sebagainya). Kontrol positif dan negatif yang tepat bersifat sangat penting dalam pengukuran ekspresi intraseluler.
B. Analisis siklus sel
Pewarna fluoresen yang berikatan dengan DNA [propidium iodide (PI) atau Hoechst 33342] dapat digunakan untuk mengukur jumlah DNA pada setiap sel. Sel yang berada di fase S akan tampak lebih terang dari sel di fase G1, sedangkan sel di fase G2 akan tampak dua kali lebih terang dari fase G1. Pewarna fluoresen lain yang dapat mewarnai DNA dengan sifat eksitasi dan emisi juga dapat digunakan, akan tetapi harus diperhatikan apakah pewarna tersebut bersifat permeabel terhadap membran sel dan spesifik untuk DNA. Sel mungkin perlu dipermeabilisasikan dan/atau diberikan perlakuan RNase sebelum pewarnaan.
Tabel 1. Cell Cycle Assay Kit dari Elabscience
| Katalog | Produk Siklus Sel Assay | Fluorokrom | Ukuran |
| E-CK-A351 | Cell Cycle Assay Kit (Red Fluorescence) | PI | 50T/100T |
C. Apoptosis.
Pada tahap awal apoptosis, residu fosfatidil serin (PS) yang umumnya hanya ada di dalam membran plasma akan berpindah ke bagian permukaan luar. Deteksi kejadian ini dapat dilakukan menggunakan PS binding protein, annexin V, berlabel fluorokrom dapat digunakan. Kombinasi PI (permeabel terhadap sel sekarat dan sel mati) dan annexin V memungkinkan untuk mendeteksi sel pada fase awal dan akhir apoptosis. FSC dan SSC juga merupakan parameter yang berguna untuk mendeteksi sel mati karena memiliki nilai FSC dan SSC yang lebih kecil dibandingkan sel hidup.
Tabel 2. Apoptosis Assay Kit dari Elabscience
| Katalog | Produk Apoptosis Assay | Fluorokrom | Ukuran |
| TUNEL Flow Cytometry Apoptosis Kit | |||
| E-CK-A420 | One-step TUNEL Flow Cytometry Apoptosis Kit (Green, FITC) | FITC | 50T/100T |
| E-CK-A421 | One-step TUNEL Flow Cytometry Apoptosis Kit (Green, Elab Fluor® 488) | Elab Fluor® 488 | 50T/100T |
| E-CK-A422 | One-step TUNEL Flow Cytometry Apoptosis Kit (Red, Elab Fluor® 594) | Elab Fluor® 594 | 50T/100T |
| E-CK-A423 | One-step TUNEL Flow Cytometry Apoptosis Kit (Blue, Elab Fluor® Violet 450) | Elab Fluor® Violet 450 | 50T/100T |
| E-CK-A424 | One-step TUNEL Flow Cytometry Apoptosis Kit (Red, Elab Fluor® 647) | Elab Fluor® 647 | 50T/100T |
| E-CK-A425 | One-step TUNEL Flow Cytometry Apoptosis Kit (Red, Elab Fluor® 555) | Elab Fluor® 555 | 50T/100T |
| TUNEL In Situ Apoptosis Kit | |||
| E-CK-A320 | One-step TUNEL In Situ Apoptosis Kit (Green, FITC) | FITC, DAPI | 50T/100T |
| E-CK-A321 | One-step TUNEL In Situ Apoptosis Kit (Green, Elab Fluor® 488) | Elab Fluor® 488, DAPI | 50T/100T |
| E-CK-A322 | One-step TUNEL In Situ Apoptosis Kit (Red, Elab Fluor® 594) | Elab Fluor® 594, DAPI | 50T/100T |
| E-CK-A324 | One-step TUNEL In Situ Apoptosis Kit (Red, Elab Fluor® 647) | Elab Fluor® 647, DAPI | 50T/100T |
| E-CK-A325 | One-step TUNEL In Situ Apoptosis Kit (Red, Elab Fluor® 555) | Elab Fluor® 555, DAPI | 50T/100T |
| E-CK-A331 | TUNEL In Situ Apoptosis Kit (HRP-DAB Method) | – | 50T/100T |
| Annexin V-Fluorokrom/PI | |||
| E-CK-A211 | Annexin V-FITC/PI Apoptosis Kit | FITC, PI | 50T/100T |
| E-CK-A213 | Annexin V-Elab Fluor® 647/PI Apoptosis Kit | Elab Fluor® 647, PI | 50T/100T |
| E-CK-A217 | Annexin V-APC/PI Apoptosis Kit | APC, PI | 50T/100T |
| E-CK-A219 | Annexin V-EGFP/PI Apoptosis Kit | EGFP, PI | 50T/100T |
| E-CK-A221 | Annexin V-Cyanine5/PI Apoptosis Kit | Cyanine5, PI | 50T/100T |
| E-CK-A229 | Annexin V-APC/Cyanine7/PI Apoptosis Kit | APC/Cy7, PI | 50T/100T |
| E-CK-A233 | Annexin V-Elab Fluor® Violet 450/PI Apoptosis Kit | EF® Violet 450, PI | 50T/100T |
| E-CK-A235 | Annexin V-Elab Fluor® Violet 500/PI Apoptosis Kit | EF® Violet 500, PI | 50T/100T |
| E-CK-A237 | Annexin V-Elab Fluor® 488/PI Apoptosis Kit | Elab Fluor® 488, PI | 50T/100T |
| E-CK-A239 | Annexin V-Elab Fluor® Red 780/PI Apoptosis Kit | Elab Fluor® Red 780, PI | 50T/100T |
| Annexin V-Fluorokrom/7-AAD | |||
| E-CK-A212 | Annexin V-FITC/7-AAD Apoptosis Kit | FITC, 7-AAD | 50T/100T |
| E-CK-A214 | Annexin V-Elab Fluor® 647/7-AAD Apoptosis Kit | Elab Fluor® 647, 7-AAD | 50T/100T |
| E-CK-A216 | Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Kit | PE, 7-AAD | 50T/100T |
| E-CK-A218 | Annexin V-APC/7-AAD Apoptosis Kit | APC, 7-AAD | 50T/100T |
| E-CK-A220 | Annexin V-EGFP/7-AAD Apoptosis Kit | EGFP, 7-AAD | 50T/100T |
| E-CK-A222 | Annexin V-Cyanine5/7-AAD Apoptosis Kit | Cyanine5, 7-AAD | 50T/100T |
| E-CK-A228 | Annexin V-PE/Cyanine7/7-AAD Apoptosis Kit | PE/Cyanine7, 7-AAD | 50T/100T |
| E-CK-A230 | Annexin V-APC/Cyanine7/7-AAD Apoptosis Kit | APC/Cyanine7, 7-AAD | 50T/100T |
| E-CK-A234 | Annexin V-Elab Fluor® Violet 450/7-AAD Apoptosis Kit | EF® Violet 450, 7-AAD | 50T/100T |
| E-CK-A236 | Annexin V-Elab Fluor® Violet 500/7-AAD Apoptosis Kit | EF® Violet 500, 7-AAD | 50T/100T |
| E-CK-A238 | Annexin V-Elab Fluor® 488/7-AAD Apoptosis Kit | Elab Fluor® 488, 7-AAD | 50T/100T |
| E-CK-A240 | Annexin V-Elab Fluor® Red 780/7-AAD Apoptosis Kit | EF® Red 780, 7-AAD | 50T/100T |
| Annexin V-Fluorokrom/DAPI | |||
| E-CK-A252 | Annexin V-FITC/DAPI Apoptosis Kit | FITC, DAPI | 50T/100T |
| E-CK-A254 | Annexin V-Elab Fluor® 647/DAPI Apoptosis Kit | Elab Fluor® 647, DAPI | 50T/100T |
| E-CK-A256 | Annexin V-PE/DAPI Apoptosis Kit | PE, DAPI | 50T/100T |
| E-CK-A258 | Annexin V-APC/DAPI Apoptosis Kit | APC, DAPI | 50T/100T |
| E-CK-A260 | Annexin V-EGFP/DAPI Apoptosis Kit | EGFP, DAPI | 50T/100T |
| E-CK-A262 | Annexin V-Cyanine5/DAPI Apoptosis Kit | Cyanine5, DAPI | 50T/100T |
| E-CK-A264 | Annexin V-PE/Cyanine5/DAPI Apoptosis Kit | PE/Cyanine5, DAPI | 50T/100T |
| E-CK-A266 | Annexin V-PE/Cyanine5.5/DAPI Apoptosis Kit | PE/Cyanine5.5, DAPI | 50T/100T |
| E-CK-A268 | Annexin V-PE/Cyanine7/DAPI Apoptosis Kit | PE/Cyanine7, DAPI | 50T/100T |
| E-CK-A270 | Annexin V-APC/Cyanine7/DAPI Apoptosis Kit | APC/Cyanine7, DAPI | 50T/100T |
| E-CK-A272 | Annexin V-PE/Elab Fluor® 594/DAPI Apoptosis Kit | PE/EF® 594, DAPI | 50T/100T |
| E-CK-A278 | Annexin V-Elab Fluor® 488/DAPI Apoptosis Kit | Elab Fluor® 488, DAPI | 50T/100T |
| E-CK-A280 | Annexin V-Elab Fluor® Red 780/DAPI Apoptosis Kit | EF® Red 780, DAPI | 50T/100T |
| Caspase Assay | |||
| E-CK-A311 | Caspase 3 Activity Assay Kit (by Spectrophotometry) | – | 136T / 228T |
| E-CK-A312 | Caspase 8 Activity Assay Kit (by Spectrophotometry) | – | 136T / 228T |
| E-CK-A313 | Caspase 9 Activity Assay Kit (by Spectrophotometry) | – | 136T / 228T |
| JC-1 Assay | |||
| E-CK-A301 | Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit (with JC-1) | – | 50T/100T |
Tabel 3. Live/Dead Cell Staining Kit dari Elabscience
| Katalog | Produk Live/Dead Cells Assay | Fluorokrom | Ukuran |
| E-CK-A354 | Calcein AM/PI Double Staining Kit | Calcein AM/PI | 500T/5000T |
| E-CK-A164 | Calcein AM Solution(100 µM) | Calcein AM | 500T/5000T |
| E-CK-A165 | PI Solution(750 µM) | PI | 500T/5000T |
| E-CK-A153 | Calcein AM Assay Buffer | – | 500 mL |
D. Pengujian proliferasi sel
CFSE (carboxyfluorescein succinimidyl ester) adalah pewarna fluoresen permeabel sel yang mampu berikatan secara kovalen dengan protein sitoplasma dan dapat dipertahankan di dalam sel. Setelah setiap pembelahan sel, CFSE diencerkan dua kali lipat sehingga intensitas sinyalnya dapat digunakan untuk mengukur proliferasi sel, sedangkan CFSE konsentrasi tinggi bersifat toksik. Pada level nontoksik, pendeteksian proliferasi dapat dilakukan sekitar 7-8 pembelahan sel sebelum sinyal berada di bawah level deteksi.
Tabel 4. Cell Proliferation Kit dari Elabscience
| Katalog | Produk Proliferasi Assay | Fluorokrom | Ukuran |
| E-CK-A370 | E-Click EdU Cell Proliferation Flow Cytometry Assay Kit (Green，FITC) | FITC | 50T/200T |
| E-CK-A371 | E-Click EdU Cell Proliferation Flow Cytometry Assay Kit (Green, Elab Fluor® 488) | Elab Fluor® 488 | 50T/200T |
| E-CK-A373 | E-Click EdU Cell Proliferation Flow Cytometry Assay Kit (Red, Elab Fluor® 647) | Elab Fluor® 647 | 50T/200T |
| E-CK-A375 | E-Click EdU Cell Proliferation Imaging Assay Kit (Green，FITC) | FITC | 50T/200T |
| E-CK-A376 | E-Click EdU Cell Proliferation Imaging Assay Kit (Green, Elab Fluor® 488) | Elab Fluor® 488 | 50T/200T |
| E-CK-A377 | E-Click EdU Cell Proliferation Imaging Assay Kit (Red, Elab Fluor® 594) | Elab Fluor® 594 | 50T/200T |
| E-CK-A378 | E-Click EdU Cell Proliferation Imaging Assay Kit (Red, Elab Fluor® 647) | Elab Fluor® 647 | 50T/200T |
E. Fluks kalsium intraseluler
Berbagai jalur pensinyalan yang menstimulasi masuknya kalsium ke dalam sel. Fluorokrom indikator kalsium permeabel sel (misalnya, Indo-1, Fluo-1-4) mampu mengubah spektrum emisi fluoresensi bergantung pada konsentrasi Ca2+. Dengan menggunakan flow cytometry, perubahan konsentrasi Ca2+ antar sel dapat diukur dan informasi tentang bagaimana sel merespons stimuli juga dapat diperoleh.
Tabel 5. Fluorokrom indicator ion Ca2+ permeabel sel dari ABP Bioscience
| Katalog | Produk Ion Indikator | Ukuran |
| C207 | Fluo-2, AM | 1 mg |
| C208 | Fluo-2, AM | 20×50 μg |
| C209 | Fluo-2, AM, 1 mg/mL in DMSO | 1 ml |
| C213 | Fluo-3, AM | 1 mg |
| C214 | Fluo-3, AM | 20×50 μg |
| C215 | Fluo-3, AM, 1 mM in DMSO | 1 ml |
| C219 | Fluo-4, AM | 0.5 mg |
| C220 | Fluo-4, AM | 10×50 μg |
| C221 | Fluo-4, AM, 1 mg/ml in DMSO | 0.5 ml |
| C233 | Rhod-2, AM | 1 mg |
| C234 | Rhod-2, AM | 20×50 μg |
| C235 | Rhod-2, AM, 1 mg/ml in DMSO | 1 ml |
| C238 | Coelenterazine | 1 mg |
F. Aplikasi diagnostik metode flow cytometry
Selain itu, pengembangan instrumen yang lebih sederhana dan terjangkau, serta peningkatan jumlah antibodi yang bermanfaat telah memfasilitasi flow cytometry dalam aspek diagnostik:
● Diagnosis leukemia/limfoma, dimana antigen permukaan leukosit diukur pada sel neoplastik.
● Detection of Minimal Residual Disease (MDR) pada pasien dalam remisi setelah leukemia atau kanker. Pengukuran CD13, CD19, CD34 dalam darah dan sumsum.
● Perhitungan sel progenitor hematopoietik untuk repopulasi sumsum tulang yang habis dengan mengukur CD34 pada stemcell
● Pencocokan silang histokompatibilitas pengukuran IgG setelah menginkubasi limfosit donor dengan serum donor.
● Pemantauan pasca transplantasi pengukuran kadar sel T CD3+ yang bersirkulasi. Disamping itu, berbagai antigen juga diukur bergantung pada jenis organ atau jaringan yang ditransplantasikan.
● Diagnosis imunodefisiensi. Sel positif CD4 dan CD8 diukur dalam darah dan jaringan limfoid.
● Diagnosis infeksi HIV. Pengukuran limfosit CD4 positif di darah
● Pengukuran Hemoglobin F, rhesus D eritrosit ibu untuk kuantifikasi perdarahan atau hemoragi fetomaternal.
● Enumerasi retikulosit. Perhitungan RNA untuk membedakan retikulosit dari eritrosit.
● Pengukuran leukosit pengkontaminasi dalam darah untuk transfusi. Deteksi leukosit menggunakan channel FSC, SSC dan antigen leukosit.
● Pengukuran konten DNA untuk mendeteksi malignansi.
● Penyakit auto-/allo-imun. Pendeteksian IgG dan IgM untuk antibodi antiplatelet serta IgG untuk antibodi antineutrofil.
G. Referensi
1. Hawley TS, Hawley RG. 2018. Flow Cytometry Protocols. Humana Press.
2. Jalali M, Saldanha FYL, Jalali M. 2017. Basic Science Methods for Clinical Researchers. Academic Press.
3. Ortolani C. 2022. Flow Cytometry Today: Everything You Need to Know about Flow Cytometry. Springer.
H. Artikel Terkait
1. Introduksi Flow Cytometer dan Prinsip Kerjanya [Link]
2. Bagaimana Memilih Antibodi untuk Flow Cytometry [Link]
3. Cell Line Merk Elabscience [Link]
4. Prosedur Dasar Laboratorium untuk Pemeliharaan Kultur Sel [Link]
5. 4 Metode Mengukur Proliferasi Sel [Link]
6. 6 Alasan Memilih Kit Deteksi Apoptosis Annexin V Merk Elabscience® [Link]
7. 4 Alasan Memilih Kit Cell Proliferation and Toxicity Merk Elabscience® [Link]
8. 5 Alasan Memilih Kit TUNEL Assay Merk Elabscience® [Link]