Sintesis oligonukleotida adalah proses kimia pembuatan untaian pendek DNA atau RNA yang disebut oligonukleotida dengan urutan basa nitrogen spesifik. Proses ini menggunakan blok pembangun nukleotida yang dikenal dengan fosforamidit yang dihubungkan secara kimiawi satu per satu. Oligonukleotida DNA disintesis secara 3′–5′ dengan menggabungkan deoksinukleosida fosforamidit yang diaktifkan asam ke deoksinukleosida awal yang terikat pada penyangga padat (biasanya manik-manik kaca berpori terkontrol (CPG) atau polistirena (PS)) melalui gugus 3′-hidroksilnya. Pada sebagian besar sintesis DNA komersial, matriks penyangga padat dikemas ke dalam kolom aliran dan reagen yang diperlukan untuk siklus sintesis fosforamidit mengalir melalui matriks penyangga padat. Penambahan setiap monomer nukleotida ke rantai oligonukleotida yang sedang tumbuh dilakukan dalam empat langkah, yaitu: deprotection, coupling, capping dan oxidation.

Gambar 1. Ilustrasi sintesis oligonukleotida dari forforamidit. Sumber: Hughes and Ellington, 2017

Deproteksi yaitu proses dimana asam lemah digunakan untuk menghilangkan gugus eter dimetoksitritil (DMT) dari ujung 5′ rantai oligonukleotida yang sedang tumbuh, menyisakan gugus 5′-hidroksil (-OH) yang reaktif untuk langkah penggandengan selanjutnya. Coupling dimulai dengan penggandengan gugus 5′-OH yang reaktif bereaksi dengan monomer yang diaktifkan tetrazole dengan penambahan simultan larutan monomer dan aktivator. Proses capping yaitu proses pemblokiran setiap gugus 5′-OH yang tidak bergandengan diblokir dengan asilasi untuk meminimalkan pembentukan produk penghapusan. Tahap terakhir yaitu tahap oxidation yaitu proses dimana ikatan internukleotida triester fosfit yang relatif tidak stabil dioksidasi menjadi ikatan fosfotriester yang lebih stabil. Proses siklik ini diulang sampai oligonukleotida selesai.

Oligonukleotida yang sudah berhasil disintesis kemudian dipisahkan dari solid buffer, dan gugus pelindung yang tersisa dihilangkan dengan perlakuan menggunakan basa kuat seperti amonium hidroksida . Sintesis oligonukleotida dengan panjang <  100  nt umum dilakukan menggunakan kimia fosforamidit fase padat dengan efisiensi penggabungan yang dapat mendekati 99%. Namun, selama deproteksi asam, reaksi samping depurinasi membatasi kualitas dan hasil oligonukleotida di atas 100  nt. Modifikasi terbaru dari kondisi reaksi tradisional menggunakan proses detritylation baru telah dilaporkan untuk mengatasi masalah ini dan dapat menghasilkan sintesis oligonukleotida yang lebih baik hingga  panjang 150 nt. Informasi lebih lanjut mengenai isolasi dan purifikasi protein dapat diakses pada link berikut.

Purifikasi Oligonukleotida

Purifikasi oligonukleotida adalah proses pemurnian segmen pendek DNA atau RNA (oligo) dari kontaminan seperti nukleotida yang tidak bereaksi, garam, dan produk sampingan sintesis untuk mencapai kemurnian tinggi yang diperlukan untuk aplikasi biologi molekuler seperti PCR, sekuensing, atau terapi gen. Proses ini diperlukan karena berbagai pengotor seperti DNA templat dan enzim transkripsi, tetap ada dalam produk mentah setelah sintesis. Tujuan purifikasi ini adalah untuk Meningkatkan Kemurnian dengan menghilangkan kontaminan yang dapat mengganggu reaksi biokimia, seperti PCR atau hibridisasi probe. Proses ini juga bertujuan untuk memisahkan produk target dengan mengisolasi oligonukleotida yang diinginkan dari fragmen yang lebih pendek (n-1) atau yang tidak lengkap. Selanjutnya akan dibahas terkait beberapa metode purifikasi oligonukleotida.

Purifikasi Nukleotida metode Cosmosil

Metode cosmosil untuk purifikasi oligonukleotida menggunakan reversed-phase high-performance liquid chromatograph (RP-HPLC). Metode ini dapat memisahkan oligonukleotida panjang penuh dari pengotor sintesis seperti mer pendek dengan memanfaatkan perbedaan hidrofobisitas, seringkali dengan fase gerak basa dan suhu tinggi untuk resolusi yang lebih baik. Kolom-kolom ini umumnya memiliki pori-pori super lebar, memungkinkan pemisahan efisien berbagai panjang RNA/DNA, bahkan ribuan basa, mendukung skala analitik dan preparatif, seringkali dikombinasikan dengan Kromatografi Pertukaran Anion (AEX) untuk kemurnian yang komprehensif.

Prinsip dan metode pemurnian diawali dengan proses RP-HPLC yang memisahkan berdasarkan hidrofobisitas, yang dapat menghapus debris atau pengotor dari sekuens target. Menggunakan suhu tinggi untuk RNA/DNA sekuens panjang untuk menjaga kelarutan dan meningkatkan pemisahan dengan mengurangi struktur sekunder. Fase gerak alkalin yang menggunakan buffer seperti TEAA atau fosfat, dapat menjaga agar oligonukleotida tetap bermuatan dan meningkatkan pemisahan dari pengotor yang kurang bermuatan. Terakhir adalah pemurnian ortogonal yang sering dikombinasikan dengan kromatografi pertukaran ion (AEX) yang dapat menghilangkan pengotor berdasarkan panjang (mer pendek/panjang) setelah dilakukan RP-HPLC.

Berikut contoh kolom cosmosil dari Nacalai tesque yang dapat kami supply untuk kebutuhan riset anda.

Purifikasi Oligonukleotida metode Column Kit

Purifikasi oligonukleotida metode column kit menggunakan silica spin column dan buffer untuk mengisolasi DNA kualitas tinggi secara cepat. Metode ini juga dapat digunakan untuk mengisolasi protein dengan mengikat membran molekul target dengan binding buffer, menghilangkan kontaminan dengan wash buffer dan elusidasi sampel murni dengan elution buffer melalui sentrifugasi sederhana. Oleh karena itu, metode sederhana ini cocok untuk diaplikasikan dalam PCR, sekuensing dan cloning.

Keuntungan menggunakan metode column kit ini adalah kecepatan tinggi yang umumnya hanya membutuhkan 30 menit. Selain itu kemurnian dan hasil yang tinggi serta fleksibilitas tinggi juga menjadi alasan untuk memilih column kit ini. Jenis kit ini pada umumnya dibedakan berdasarkan jenis protein yang dipurifikasi, seperti DNA purification kit, RNA purification kit dan protein purification kit.

Berikut beberapa column kit dari brand Elabscience dan Solarbio yang dapat kami supply untuk kebutuhan riset anda:

Purifikasi Oligonukleotida metode DSL Reagent

Metode ini merupakan metode purifikasi oligonukleotida menggunakan Desalting/desalination yang umumnya dikombinasikan dengan proses purifikasi cartridge-based (OPC). Metode ini pada dasarnya akan menghilangkan garam, kontaminan organik kecil dan beberapa kesalahan sekuens yang menghasilkan kemurnian 80% atau lebih.

Pada sintesis oligonukleotida pase padat, gugus dimetoksitritil (DMT) terakhir dapat dibiarkan (DMT-ON) untuk membantu pemurnian. Oligonukleotida kemudian dipisahkan dari penyangga sintesis dan dideproteksi. Produk mentah, yang masih mengandung garam dan sekuens terpotong (sekuens gagal), kemudian dikenakan proses DSL. Reagent yang terkait pada proses ini antara lain binding reagents, washing reagent dan detritylation/elution. Reagen spesifik yang digunakan pada metode DSL adalah  Trietilamonium Asetat (TEAA) yang digunakan sebagai buffer dan agen pengikat ion dalam fase gerak; Asetonitril (MeCN) yang digunakan dalam buffer pencucian dan elusi, seringkali dalam berbagai konsentrasi; Asam Trifluoroasetat (TFA) dalam larutan air yang digunakan untuk menghilangkan gugus pelindung DMT terakhir; Amonium Hidroksida Pekat yang umumnya digunakan dalam langkah pemutusan dan deproteksi awal sebelum pemurnian.

Purifikasi Oligonukleotida metode PAGE

Purifikasi oligonukleotida menggunakan metode PAGE (Polyacrylamide Gel Electrophoresis) merupakan teknik efektif untuk memisahkan oligonukleotida berdasarkan ukuran (berat molekul) dan memurnikannya dari kontaminan, dengan cara mengelusi oligo target dari gel setelah visualisasi dan ekstraksi. Metode ini menghasilkan kemurnian tinggi yang digunakan untuk aplikasi seperti PCR, sekuensing, atau terapi gen.

Prinsip kerja metode dimulai dengan proses elektroforesis, pemisahan, visualisasi dan ekstraksi. Elektroforesis menggunakan medan listrik dengan cara menambahkan oligonukleotida ke dalam gel yang mengandung urea. Setelah dialiri listrik, oligo akan menuju anoda karena muatan negatifnya. Selanjutnya proses pemisahan dilakukan berdasarkan panjang basa nya dan dilanjutkan dengan visualisasi menggunakan pewarna. Proses terakhir adalah ekstraksi dengan memotong pita oligo target dari gel. Oligo target kemudian diekstraksi menggunakan buffer. Metode PAGE umum digunakan karena resolusi dan kemurnian yang tinggi serta sesuai untuk aplikasi sensitif seperti qPCR, sekuensing, siRNA/shRNA yang membutuhkan akurasi tinggi.

Berikut beberapa produk terkait metode PAGE dari brand Solarbio yang dapat kami supply untuk kebutuhan riset anda:

Apabila terdapat kebutuhan dan pertanyaan dapat langsung mengontak kami pada link berikut. Terimakasih.

Source:

Hughes RA, Ellington AD. Synthetic DNA Synthesis and Assembly: Putting the Synthetic in Synthetic Biology. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2017 Jan 3;9(1):a023812. doi: 10.1101/cshperspect.a023812. PMID: 28049645; PMCID: PMC5204324.

https://synbio-tech.com/oligo-synthesis-purification-methods

Flett F, Interthal H. Separation of DNA oligonucleotides using denaturing urea PAGE. Methods Mol Biol. 2013;1054:173-85. doi: 10.1007/978-1-62703-565-1_11. PMID: 23913292.