Sejarah penemuan enzim restriksi diawali pada tahun 1950-an dimana peneliti mengamati bahwa bakteri dapat menghancurkan DNA virus bacteriophage yang menyerangnya. Peneliti kemudian menemukan bahwa bakteri dapat menghasilkan enzim khusus untuk memotong dan menghancurkan DNA asing pada lokasi tertentu. Enzim ini merupakan endonuklease yang disintesis oleh bakteri untuk memotong DNA spesifik sebagai sebuah bentuk pertahanan diri.

Definisi Enzim Restriksi

Enzim restriksi merupakan protein yang disintesis oleh bakteri yang dapat memotong atau membelah DNA pada lokasi tertentu. Sintesis enzim ini oleh bakteri digunakan untuk pertahanan diri bakteri tersebut untuk membelah DNA asing dan menghilangkan organisme yang dapat menginfeksi (bacteriophage). Sistem ini mencegah adanya replikasi DNA phage dan memotongnya menjadi beberapa bagian.

Pemberian nama ‘restriksi’ pada tipe enzim ini didasarkan pada kemampuan ‘membatasi’ jumlah strain bacteriophage yang dapat menginfeksi bakteri. Enzim restriksi endonuklease ini akan mengenali urutan nukleotida spesifik dan memotong DNA diantara atau di luar sekuens yang dikenalinya tersebut. Ketika enzim ini mengenali sebuah urutan, ia dapat memotong sekuens tersebut dengan mengkatalisis hidrolisis (pemisahan ikatan kimia dengan penambahan molekul air) ikatan antara nukleotida yang berdekatan.

Gambar 1: Ilustrasi pemotongan sekuens DNA oleh enzim restriksi.

Terdapat 4 tipe enzim restriksi yang dikenali dan dibedakan berdasarkan struktur, tempat pembelahan, spesifisitas, dan kofaktor.

1. Enzim restriksi tipe I memiliki struktur gabungan dari endonuklease, methylase dan ATPase yang dapat mengenali urutan spesifik 4-6 bp dan membutuhkan ATP dan Mg2+ dalam proses pemotongan. Namun enzim ini memotong jauh dari sekuens yang dikenali sehingga hasil pemotongan tidak spesifik.
2. Enzim restriksi tipe II hanya terdiri dari endonuklease, tidak membutuhkan ATP dan memotong tepat pada situs pengenalan.
3. Enzim restriksi tipe III memiliki aktivitas endonuklease dan methyltransferase dan dapat memotong 20-30bp dari sekuens yang dikenali. Pemotongan yang dilakukan oleh enzim restriksi tipe III membutuhkan ATP dan Mg2+.
4. Enzim restriksi tipe IV dapat mengenali dan memotong DNA yang telah dimodifikasi, seperti metilasi dan modifikasi kimia lainnya, namun tidak reaktif pada DNA normal. Enzim restriksi tipe IV tidak mengenali urutan basa spesifik, namun mengenali modifikasi kimia pada DNA.

Fungsi dan Aplikasi Enzim Restriksi

Kemampuan enzim restriksi untuk memotong DNA spesifik digunakan dengan sebagai alat dalam berbagai teknik pada biologi molekuler. Fungsi enzim restriksi pada biologi molekuler adalah dengan memotong DNA pada urutan spesifik, umumnya 4-8bp. Memotong sekuens DNA dengan due jenis pemotongan, yaitu ujung menempel (sticky ends) dan ujung tumpul (blunt end). Ujung menempel (sticky ends) didefinisikan sebagai untaian tunggal yang dihasilkan oleh pemotongan enzim restriksi yang tidak simetris. Ujung tempel ini lebih mudah digabungkan dengan fragmen DNA lain dengan ujung yang komplemen dengan ujung yang dimiliki. Ujung tumpul merupakan hasil pemotongan simetris oleh enzim restriksi dan tidak memiliki untaian tunggal yang menonjol. Tipe ujung yang tumpul lebih sulit digabungkan dengan fragmen DNA lainnya sehingga membutuhkan ligase DNA.

Aplikasi enzim restriksi pada biologi molekuler dikelompokkan menjadi beberapa poin dibawah:

1. DNA Cloning

Aplikasi utama yang menggunakan enzim restriksi sebagai alat adalah DNA cloning. Enzim restriksi dapat digunakan untuk memisahkan DNA pada lokasi spesifik dan menggunakan DNA ligase untuk menggabungkan dengan fragmen DNA lainnya.

2. DNA Fingerprinting

Teknik ini digunakan untuk identifikasi individu dengan profil DNA unik yang hanya dimiliki individu tersebut. Enzim restriksi memotong DNA sample dari individu berbeda pada lokasi pengenalan spesifik yang menghasilkan pola fragmen yang dapat dibandingkan antar-individu.

3. Gene Editing

Proses ini memodifikasi sekuens DNA pada sel hidup. Sistem CRISPR-Cas9 merupakan alat editing gen yang menggunakan molekul RNA untuk mengarahkan Cas9 enzim pada lokasi spesifik pada genome. Pada saat enzim Cas9 berikatan dengan lokasi target, dapat mengaktivasi pemotongan DNA. Dengan kemampuan ini, enzim restriksi dapat digunakan untuk memodifikasi atau merubah secara spesifik sebuah genome.

4. Protein Expression

Proses ini memproduksi spesifik protein pada sel hidup. Untuk menghasilkan protein yang dibutuhkan, sekuens DNA yang mengkodekan protein dimasukkan kedalam vektor plasmid dan diperkenalkan pada sel bakteri. Vektor plasmid mengandung sekuens promotor yang dapat mengekspresikan protein dan lokasi restriksi yang dapat dipotong ketika dibutuhkan. Pemotongan tersebut akan dilakukan oleh enzim restriksi, begitu pula dengan modifikasi beberapa bagian dari vektor plasmid untuk optimalisasi ekspresi protein.

5. Molecular Diagnostics

Enzim restriksi digunakan pada diagnostik molekuler untuk diagnosis penyakit atau penyakit genetik. Enzim restriksi digunakan untuk memotong sampel DNA pasien pada lokasi spesifik. Potongan sekuens DNA ini kemudian akan digunakan untuk identifikasi mutasi atau perubahan genetik lainnya yang kemungkinan berkaitan dengan penyakit tertentu. Teknik ini juga digunakan untuk mengetahui resiko penyakit genetik tertentu.

Berikut merupakan beberapa produk enzim restriksi dari Brand Cusabio.

Source:

https://www.britannica.com/science/restriction-enzyme

Loenen WA, Dryden DT, Raleigh EA, Wilson GG. Type I restriction enzymes and their relatives. Nucleic Acids Res. 2014 Jan;42(1):20-44. doi: 10.1093/nar/gkt847. Epub 2013 Sep 24. PMID: 24068554; PMCID: PMC3874165.

Mustapha, Abdulsalam & Hamza, Fatima & Saddeeq, Fatima & Ibrahim, Hafsa & Dutse, Hafsa & Falaki, Aisha. (2024). Unveiling the Molecular Symphony: Exploring Mechanisms, Diversity and Applications of Restriction Enzymes in Biology. International Journal of Applied and Scientific Research. 2. 325-342. 10.59890/ijasr.v2i3.1554.

https://molecular-tools.creative-enzymes.com/applications-of-restriction-endonucleases.html