A. One Step TUNEL In Situ

Gambar 1. Visualisasi One-step TUNEL In Situ Apoptosis Kit (Green, Elab Fluor® 488)

One-step TUNEL In Situ adalah metode deteksi apoptosis yang digunakan untuk mengidentifikasi sel-sel yang mengalami kematian terprogram (apoptosis) dengan cara mendeteksi fragmentasi DNA pada tahap akhir apoptosis. Prinsip utamanya adalah sebagai berikut:

• Saat sel mengalami apoptosis, endonuklease khusus akan mengaktifkan pemotongan DNA genomik di antara nukleosom, menghasilkan fragmen DNA berukuran sekitar 180–200 pasangan basa.
• Fragmen DNA ini memiliki ujung 3′-OH yang terekspos. Enzim Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT) kemudian mengkatalisis penambahan dUTP berlabel fluoresen pada ujung-ujung DNA tersebut.
• Label fluoresen ini dapat dideteksi menggunakan mikroskop fluoresensi, sehingga sel apoptotik dapat divisualisasikan secara langsung.

Metode ini dikenal sebagai “one-step” karena menggabungkan reagen TdT dan dUTP berlabel dalam satu langkah reaksi, sehingga prosedurnya lebih cepat, sensitif, dan hasilnya lebih mudah diinterpretasikan dibandingkan metode tradisional.

Ciri-ciri dan penggunaan One-step TUNEL In Situ:

• Digunakan pada berbagai tipe sampel seperti preparat jaringan parafin, preparat beku, dan sel pada slide.
• Waktu uji sekitar 3 jam.
• Deteksi menggunakan mikroskop fluoresensi dengan filter sesuai jenis fluorofor
• Cocok untuk penelitian apoptosis dalam berbagai bidang biologi dan kedokteran, termasuk penelitian kanker dan neurodegenerasi

Tabel 1. Produk One Step TUNEL In Situ dari Elabscience

 B. One-Step TUNEL Flow Cytometry

Gambar 2. Visualisasi hasil One-step TUNEL Flow Cytometry Apoptosis Kit (Blue, Elab Fluor® Violet 450)

One-step TUNEL Flow Cytometry adalah metode deteksi apoptosis yang menggunakan prinsip labeling DNA terfragmentasi pada sel yang mengalami kematian terprogram (apoptosis) dengan teknik flow cytometry secara langsung dan efisien dalam satu langkah reaksi. Metode ini biasanya di aplikasikan pada penelitian apoptosis pada berbagai jenis sel dan jaringan, evaluasi efek obat atau perlakuan yang menginduksi apoptosis dan studi dalam bidang imunologi, onkologi, dan biologi sel.

Prinsip kerjanya adalah sebagai berikut:

• Saat apoptosis terjadi, endonuklease mengaktifkan pemotongan DNA genomik di antara nukleosom menjadi fragmen-fragmen DNA berukuran sekitar 180–200 pasangan basa dengan ujung 3′-OH yang terbuka.
• Enzim Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT) mengkatalisis penambahan dUTP berlabel fluoresen (misalnya fluorescein atau Elab Fluor®) pada ujung-ujung DNA tersebut.
• Selanjutnya, sel yang mengandung DNA terlabel ini dianalisis menggunakan flow cytometry untuk mengukur intensitas fluoresensi, sehingga populasi sel apoptotik dapat diidentifikasi dan dikuantifikasi secara cepat dan akurat.

Berikut merupakan keunggulan One-step TUNEL Flow Cytometry :

• Protokol satu langkah yang menggabungkan enzim TdT dan dUTP berlabel dalam satu reagen, sehingga mengurangi waktu dan kompleksitas prosedur.
• Dapat digunakan untuk mendeteksi apoptosis pada sel suspensi maupun sel adheren setelah proses fiksasi dan permeabilisasi.
• Memberikan analisis kuantitatif yang sensitif dan spesifik terhadap sel yang mengalami fragmentasi DNA akibat apoptosis.
• Memungkinkan analisis populasi sel secara cepat dan high-throughput dengan flow cytometer.

 Tabel 2. Produk One-Step TUNEL Flow Cytometry dari Elabcience

 C. TUNEL In Situ(HRP-DAB Method)

TUNEL In Situ (HRP-DAB Method) adalah teknik deteksi apoptosis yang menggunakan prinsip pelabelan ujung DNA yang terfragmentasi pada sel yang mengalami kematian terprogram (apoptosis) dengan metode pewarnaan kromogenik berbasis horseradish peroxidase (HRP) dan substrat DAB (diaminobenzidine).

Prinsip Kerja dari metode ini adalah sebagai berikut :

• Saat apoptosis terjadi, endonuklease mengaktifkan pemotongan DNA genomik di antara nukleosom, menghasilkan ujung DNA 3′-OH yang bebas.
• Enzim Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (TdT) mengkatalisis penambahan biotinylated dUTP pada ujung-ujung DNA tersebut.
• Biotin yang terikat kemudian dikenali oleh Streptavidin yang dilabeli dengan HRP (Horseradish Peroxidase).
• HRP mengkatalisis reaksi oksidasi substrat DAB, menghasilkan endapan coklat yang dapat diamati dengan mikroskop cahaya biasa.

Produk TUNEL In Situ(HRP-DAB Method) dari Elabscience yaitu TUNEL In Situ Apoptosis Kit (HRP-DAB Method) (No. Katalog : E-CK-A331). Berikut merupakan visualisasi hasil dari produk tersebut

Gambar 3. Visualisasi Hasil TUNEL In Situ Apoptosis Kit (HRP-DAB Method)

D. Perbedaan One-step TUNEL In Situ, One-step TUNEL Flow
Cytometry, dan TUNEL In Situ (HRP-DAB Method)

Berikut adalah perbedaan utama antara One-step TUNEL In Situ, One-step TUNEL Flow Cytometry, dan TUNEL In Situ (HRP-DAB Method) dari merk Elabscience berdasarkan prinsip kerja, metode deteksi, jenis sampel, dan aplikasi:

Tabel Perbedaan One-step TUNEL In Situ, One-step TUNEL Flow Cytometry, dan TUNEL In Situ (HRP-DAB Method)

E. Referensi

1. https://www.elabscience.com/products/tunel-assay-kits
2. Loo, DT. 2011. In situ detection of apoptosis by the TUNEL assay: an overview of techniques. Methods Mol Biol. 682:3-13.
3. Kyrylkova, K., Kyryachenko, S., Leid, M., Kioussi, C. 2012. Detection of apoptosis by TUNEL assay. Methods Mol Biol. 887:41-7.